郄 濤， 徐 鵬， 張丙信， 曹雪濱△

(1. 保定市第一中心醫(yī)院急診科， 河北 保定 071000； 2. 陸軍第82集團(tuán)軍醫(yī)院心內(nèi)科， 河北 保定 071000；3. 保定市第一中心醫(yī)院病理科， 河北 保定 071000)

運(yùn)動(dòng)是機(jī)體的一種外在刺激, 運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度不同會(huì)對(duì)心臟產(chǎn)生不同影響。適宜運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟有益，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)如力竭性運(yùn)動(dòng)，超出人或動(dòng)物生理極限，則導(dǎo)致心臟損傷。在當(dāng)今軍隊(duì)高強(qiáng)度實(shí)戰(zhàn)化訓(xùn)練和體育競(jìng)技中，如何進(jìn)行科學(xué)的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，減少運(yùn)動(dòng)和訓(xùn)練所致的心肌損傷，提高成績(jī)是軍事訓(xùn)練和體育運(yùn)動(dòng)中需關(guān)注的課題。

力竭運(yùn)動(dòng)是疲勞運(yùn)動(dòng)的一種特殊形式，是在疲勞時(shí)繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，直到肌肉和器官不能維持運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)[1]。力竭運(yùn)動(dòng)造成心肌損傷，課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)力竭運(yùn)動(dòng)可造成心臟超微結(jié)構(gòu)破壞，心功能減低及心電改變，能量代謝障礙、線粒體功能異常[2-4]。力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)體內(nèi)代謝率增加，心肌需氧量增加，導(dǎo)致心肌缺血缺氧。趙敬國(guó)發(fā)現(xiàn)大鼠心電圖在力竭運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)心肌缺血導(dǎo)致ST-T變化。心肌缺血缺氧是力竭運(yùn)動(dòng)所致心臟損傷的始動(dòng)因素。力竭運(yùn)動(dòng)能上調(diào)心肌絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中p38磷酸化水平，其與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的[5]。Carraro等的研究顯示，力竭運(yùn)動(dòng)及過度訓(xùn)練可致心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加。因此凋亡亦是造成力竭運(yùn)動(dòng)心臟損傷的原因之一。目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡主要通過細(xì)胞外死亡受體和細(xì)胞內(nèi)線粒體介導(dǎo)的兩條途徑實(shí)現(xiàn)。因此，本試驗(yàn)觀察本方案力竭運(yùn)動(dòng)凋亡情況及對(duì)上述凋亡途徑的影響。

紅景天苷(salidroside, Sal)由植物紅景天中高效萃取所得，其具有力竭心臟保護(hù)作用，可有效減少力竭所致的心肌結(jié)構(gòu)損傷，改善心肌缺血，并改善心肌線粒體能量代謝[2]。紅景天苷可抑制缺血/再灌注損傷、急性心肌缺血缺氧等多種因素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[6, 7]。因此，本實(shí)驗(yàn)觀察紅景天苷能否通過減少心肌缺血，調(diào)控心肌細(xì)胞死亡受體和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)蛋白來改善力竭運(yùn)動(dòng)所致心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對(duì)力竭心肌的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

MutiscanGO 酶標(biāo)儀，SIGMA 3K15高速冷凍離心機(jī)。99%紅景天苷粉劑(Lot：080901-1)，缺血修飾白蛋白(ischemia modified albumin, IMA)檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(武漢華美公司)，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)試劑盒(南京建成公司)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)試劑盒(武漢華美公司)，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roch公司)。Caspase-8 、Bax、Bcl-2抗體(英國(guó)Abcam公司)，Caspase-3、Caspase-9、Fas/FasL、細(xì)胞色素C(Cytochrome C，Cyto-C)抗體(美國(guó)SantaCruz公司)，β-actin抗體(Sigma公司)，二抗(中杉金橋公司)，HRP顯色試劑盒(Piece公司)。

1.2 動(dòng)物分組及模型制備

雄性SD大鼠24只，體重(325±28)g，購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間進(jìn)行3次無(wú)負(fù)重適應(yīng)性游泳，每次 25 min。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為4組(n=6)：對(duì)照組(Con)、力竭組(EE)、低劑量紅景天苷預(yù)處理力竭組(SLE)、高劑量紅景天苷預(yù)處理力竭組(SHE)。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，SLE、SHE組分別給予紅景天苷(15，30 mg/(kg·d))，Con組、EE組給予0.9%NaCl(3 ml/(kg·d))腹腔注射15 d。于給藥結(jié)束后次日正式實(shí)驗(yàn)，正式實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12 h。實(shí)驗(yàn)時(shí)Con組不進(jìn)行游泳訓(xùn)練。于腹腔給藥結(jié)束后次日EE組、SLE組、SHE組大鼠分別負(fù)體重質(zhì)量3%錫絲，按Thomas力竭標(biāo)準(zhǔn)，一次性游泳運(yùn)動(dòng)至力竭。大鼠游泳槽為清潔塑料圓桶，高60 cm，直徑55 cm，水深50 cm。水溫控制在32℃，上下浮動(dòng)不超過1℃。力竭運(yùn)動(dòng)結(jié)束后即刻麻醉取材。

1.3 血清及心肌標(biāo)本采集及制備

對(duì)照組及力竭組大鼠戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，開胸下腔靜脈取血，3 000 r/min, 離心20 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取血后快速將心臟取出，用冷生理鹽水洗凈。于心尖部心室前壁肌切取小塊心肌組織，4%多聚甲醛中固定24 h后，用梯度濃度酒精行常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后進(jìn)行切片，6～8張，厚度為4 μm，用涂有多聚賴氨酸的載玻片貼片，56℃烘烤40 min備用。其余心肌-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 蘇木精-堿性復(fù)紅-苦味酸(hematoxylin basic fuchsin picric acid，HBFP)染色法觀測(cè)心肌缺血缺氧面積

將心肌組織制成切片，切片脫蠟至水，蘇木素染液浸染5 min，流水沖洗5 min；1%鹽酸分化2～3 s，流水沖洗10 min；0.1%堿性紅液3 min，蒸餾水洗5～10 s；純丙酮5～10 min；0.1%苦味酸純丙酮浸染5～15 min；二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并攝片。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理。測(cè)定每個(gè)視野的心肌缺血缺氧面積。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IMA、cTnI、BNP血清含量

按照試劑盒操作步驟測(cè)定每組大鼠血清中IMA、cTnI、BNP含量，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的OD值及標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣本OD值計(jì)算各樣本濃度。

1.6 大鼠心肌細(xì)胞凋亡的原位標(biāo)記(TUNEL)檢測(cè)與半定量分析

細(xì)胞凋亡的原位標(biāo)記檢測(cè)是每一標(biāo)本取3個(gè)不同部位的切片各1張。脫蠟，再梯度水合后采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT酶)介導(dǎo)的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)。具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。每張切片隨機(jī)拍攝5個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)，以凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比的平均值作為凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。

1.7 免疫組化檢測(cè)大鼠心肌Bax、Bcl-2含量

采用SP法, 按照試劑盒說明書, 陰性對(duì)照用PBS 代替一抗。若胞漿呈棕黃色背景，棕黃色顆粒沉積于細(xì)胞胞漿即陽(yáng)性反應(yīng)；若細(xì)胞核及膜為藍(lán)色，其它部分顯示淡藍(lán)色即為陰性反應(yīng)。利用低倍、高倍光鏡著重觀察心肌組織的陽(yáng)性反應(yīng)情況。結(jié)果用灰度值表示。

1.8 Western-blot法檢測(cè)大鼠心肌Fas、Cyto-C、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9含量

各組在適量細(xì)胞裂解液(已做冰預(yù)冷處理)中分別加入200 mg大鼠左心室前壁心肌組織，冰上裂解40 min。 4℃，12 000 r·min-1，離心20 min，之后收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，100 V 2 h轉(zhuǎn)PVDF膜，5%BSA封閉1 h，一抗稀釋濃度Fas 1∶500、Cyto-C 1∶ 1 000、Caspase-3 1∶1 000、Caspase-8 1∶500、Caspase-9 1∶500，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次，每次10 min，后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL檢測(cè)試劑盒顯影、洗片。 用Bandleader 5.0軟件對(duì)掃描后圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織缺血缺氧面積的影響

HBFP染色結(jié)果顯示，Con組大鼠心室結(jié)構(gòu)大致正常，心肌纖維結(jié)構(gòu)相對(duì)清晰，染色均勻，各個(gè)細(xì)胞排列整齊規(guī)整，卵圓形細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，位于細(xì)胞中央，未見明顯偏離；EE組中心肌纖維呈現(xiàn)多種形態(tài)，染色相對(duì)不均勻，細(xì)胞排列不整齊，胞漿內(nèi)有大量的片狀紅色缺血缺氧改變；SLE組與SHE組心肌結(jié)構(gòu)較EE組細(xì)胞排列更加規(guī)整，心肌纖維結(jié)構(gòu)更加清晰。胞漿內(nèi)有少量的片狀紅色缺血缺氧改變，缺血缺氧程度減輕。計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果顯示：與Con相比，力竭組心肌缺血缺氧面積明顯增加(P< 0.01)。SLE組與SHE組心肌缺血、缺氧面積明顯少于EE組；且SHE組較SLE組缺血缺氧面積小(圖1)。

Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low dose sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High dose sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.2 紅景天苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠血清 IMA、cTnI、BNP含量的影響

與Con組相比，大鼠血清IMA含量EE組SLE和SHE組顯著升高(P<0.01)。SLE組和SHE組較EE組降低(P<0.01)，且SHE組較SLE組降低更為明顯(P<0.01)。血清cTnI、BNP水平與Con組比較，EE組、SLE組、SHE組均顯著升高(P<0.01)。SHE組明顯低于EE組(P<0.01，表1)。

IMA(U·ml-1)BNP(ng·L-1)c-TnI (pg·ml-1) Con15.31±1.98197.12±29.42126.81±13.48EE41.24±4.84??285.58±32.89??175.61±21.64??SLE32.09±2.06??##255.46±11.41??163.44±13.29??SHE18.85±2.17??##△△233.08±27.64??##154.20±20.42??##

IMA: Ischemia modified albumin; BNP: Brain natriuretic peptide; cTnI: Cardiac troponin I ; Con: Control group; EE: Acute exhaustive swimming group; SLE: Low does Sal pretreatment exhaustive swimming group; SHE: High does Sal pretreatment exhaustive swimming group

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.01vsSLE group

2.3 紅景天苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織AI的影響

凋亡細(xì)胞即陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)棕黃色的細(xì)胞核。Con組偶見陽(yáng)染顆粒，EE組出現(xiàn)較多散在的陽(yáng)染顆粒，Sal干預(yù)組陽(yáng)染顆粒有所減少。AI結(jié)果顯示：EE組和SLE組較Con組顯著升高(P<0.01)。SLE組和EE組兩組之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，SHE組AI降低明顯，與SLE組和EE組比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01, 圖2)。

**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△△P<0.05vsSLE group

2.4 紅景天苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌組織Bax，Bcl-2表達(dá)的影響

陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，呈棕黃色細(xì)顆粒。對(duì)照組胞漿內(nèi)可見少量的Bax陽(yáng)性表達(dá)，呈細(xì)顆粒狀，染色淺 。EE組心臟Bax陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng)，胞漿內(nèi)可見大量的點(diǎn)狀或小塊狀棕褐色顆粒；Sal干預(yù)組陽(yáng)性表達(dá)減少，SLE組內(nèi)可見較多的陽(yáng)性表達(dá)顆粒，SHE組可見少量的棕褐色顆粒。計(jì)算機(jī)圖像分析結(jié)果顯示：Bax蛋白表達(dá)量EE組、SLE組和SHE組較Con組顯著升高(P<0.01)，SHE組和SLE組較EE組明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Bcl-2蛋白表達(dá)量EE組、SLE組較Con組顯著降低(P<0.01)，SHE組較EE、SLE組明顯升高(圖3)。

**P<0.01vsCon group;#P<0.05,##P<0.01vsEE group;△P<0.05vsSLE group

2.5 紅景天苷對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠心肌Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的影響

EE組及SLE組Fas，Cyto-C，Caspase-3， Caspase-8，Caspase-9較Con組顯著升高(P<0.01)，SHE組Fas，Caspase-3，Caspase-8較Con組顯著升高。SLE組Fas，Cyto-C，Caspase-9和SHE組全部參數(shù)較EE組降低，均具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，SHE組Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8較SLE組明顯降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sal對(duì)力竭所致的心臟損傷具有保護(hù)作用。Sal可改善力竭運(yùn)動(dòng)造成的心肌缺血。Sal能降低Bax，增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax/Bcl-2比值，抑制死亡受體和線粒體凋亡通路中相關(guān)蛋白Fas、Cyto-C、Caspase-3，Caspase-8, Caspase-9的表達(dá)從而降低力竭心臟凋亡水平，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

*P<0.05,**P<0.01vsCon group;##P<0.01vsEE group;△P<0.05,△△P<0.01vsSLE group

力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)心臟需氧量急劇增加，心肌血流相對(duì)供應(yīng)不足。此外，NO與內(nèi)皮素的失衡，冠脈血流量降低，均可誘發(fā)心肌缺血。本實(shí)驗(yàn)HBFP染色表明力竭運(yùn)動(dòng)造成心肌缺血，與孫曉娟應(yīng)用跑臺(tái)進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)所得結(jié)果相同[8]。IMA是心肌缺血發(fā)生后到細(xì)胞壞死前的早期敏感特異指標(biāo)。其陽(yáng)性結(jié)果表明心肌缺血。Lee在研究運(yùn)動(dòng)負(fù)荷試驗(yàn)(EST)中發(fā)現(xiàn)IMA水平可預(yù)測(cè)EST后心肌缺血的嚴(yán)重程度[9]。紅景天苷可呈劑量依賴性減少力竭大鼠心肌缺血面積，降低IMA水平，提示紅景天苷可改善力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌缺血,但其機(jī)制需在今后研究中繼續(xù)探索。

心肌對(duì)缺血缺氧極其敏感，在缺血、缺氧的情況下，各種損害因子增多，脂質(zhì)過氧化水平增加，細(xì)胞膜穩(wěn)定性及完整性破壞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡。心肌凋亡的程度與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度有一定的關(guān)系，適度的游泳訓(xùn)練降低心肌凋亡水平[10]。但持續(xù)大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)和力竭運(yùn)動(dòng)則通過細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡兩種途徑使心肌出現(xiàn)損傷。本實(shí)驗(yàn)亦顯示力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增加。心肌細(xì)胞凋亡水平上調(diào)的直接后果就是心肌數(shù)量減少，導(dǎo)致心臟損傷。

Bcl-2家族中的抗凋亡成員Bcl-2和促凋亡成員Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要基因，主要在凋亡執(zhí)行階段發(fā)揮作用。Bax/Bcl-2比值低，細(xì)胞存活率高。本實(shí)驗(yàn)中力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞中Bax增加，Bcl-2減少，Bax/Bcl-2比值升高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。類似報(bào)道還有力竭運(yùn)動(dòng)和過度訓(xùn)練可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)下降，Bax mRNA水平升高，且二者比值明顯減小，心肌細(xì)胞凋亡顯著增加。

Fas是死亡受體介導(dǎo)凋亡途徑的啟動(dòng)因子。Fas與FasL結(jié)合后可誘導(dǎo)產(chǎn)生凋亡信號(hào)，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活Caspase-8，進(jìn)一步活化效應(yīng)型Caspase-3，引起細(xì)胞凋亡事件發(fā)生。Caspase-3的表達(dá)增強(qiáng)可以增加組織細(xì)胞的凋亡。Caspase-8是死亡受體通路的關(guān)鍵起始因子，活化的Caspase-8還能把死亡受體通路和線粒體通路聯(lián)系起來。Cyto-C是線粒體介導(dǎo)的凋亡通路的啟動(dòng)因子之一。本實(shí)驗(yàn)力竭運(yùn)動(dòng)造成心肌組織Fas、Cyto-C含量顯著增加。與金其貫、張鈞等人研究結(jié)果相同。力竭運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡通路中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等相關(guān)凋亡蛋白顯著增加。與本實(shí)驗(yàn)類似的研究也顯示，過度訓(xùn)練的大鼠腎組織Caspase-8的表達(dá)于力竭后即刻、6 h及24 h逐漸增強(qiáng)，均顯著高于對(duì)照組[11]。對(duì)青年男性專業(yè)運(yùn)動(dòng)員和大學(xué)生的研究發(fā)現(xiàn)，力竭運(yùn)動(dòng)后即刻Caspase-3和Caspase-9的活性均顯著升高。孫曉娟發(fā)現(xiàn)力竭運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，應(yīng)用抗氧化劑能夠抑制心肌細(xì)胞Caspase-3活性，減少心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量[8]。紅景天苷劑量依賴性抑制力竭心臟死亡受體和線粒體凋亡通路中的Fas，Cyto-C，Caspase-3，Caspase-8，Caspase-9的表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡，保留盡可能多的心肌細(xì)胞，從而起到力竭心臟保護(hù)作用。