劉江濤， 羅 斌， 賀小桃， 李蘭玉， 徐生剛

(1. 蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)研究所， 甘肅 蘭州 730000； 2. 河西學(xué)院醫(yī)學(xué)院， 甘肅 張掖 734000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以不完全可逆的氣流受限并呈進(jìn)行性發(fā)展為特征的肺部疾病[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，在2015年時(shí)，COPD已經(jīng)成為全球第四大死因疾病，并有可能持續(xù)惡化[2]。PM2.5是指空氣動(dòng)力學(xué)直徑小于等于2.5 μm的顆粒物，可通過(guò)呼吸道進(jìn)入人體肺部，更小的顆粒可進(jìn)入血液引起全身多個(gè)靶器官的損害。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)研究均表明，PM2.5進(jìn)入肺部，可引起肺泡巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞等分泌大量炎癥因子[3-5]，例如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素6(IL-6)等，引起全身炎癥反應(yīng)。COPD本身是一種以慢性炎癥為特征的疾病，更易受到PM2.5的影響，導(dǎo)致肺部炎癥反應(yīng)的加重，進(jìn)而導(dǎo)致COPD疾病的進(jìn)展[6]。氣溫的變化(例如高溫?zé)崂?、寒?會(huì)影響人體的健康，尤其是對(duì)于呼吸系統(tǒng)疾病患者。目前，高溫?zé)崂耸侵溉兆罡邭鉁剡_(dá)到或超過(guò)35℃并持續(xù)達(dá)3 d以上，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)高溫?zé)崂藭?huì)降低大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬功能[7]。維生素E是一種常見(jiàn)的脂溶性維生素，可有效對(duì)抗自由基，是一種重要的抗氧化劑，在體內(nèi)有一定的對(duì)抗氧化應(yīng)激及炎癥的作用[8, 9]。本研究擬通過(guò)香煙與脂多糖制造COPD大鼠模型，利用PM2.5與高溫對(duì)COPD大鼠進(jìn)行聯(lián)合暴露，并適當(dāng)給予維生素干預(yù)，觀察大鼠體內(nèi)各項(xiàng)炎性指標(biāo)的變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

脂多糖(Sigma，美國(guó))；香煙(蘭州牌，蘭州)；維生素E(雙鯨藥業(yè)，青島)；誘導(dǎo)性一氧化氮合酶(iNOS)試劑盒(南京建成，南京)；腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(Elabscience，武漢)；單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)ELISA試劑盒(Elabscience，武漢)。大氣顆粒物采樣器(Airmetrics，美國(guó))；人工氣象環(huán)境模擬箱(三元TEMI1800，韓國(guó))；大鼠肺功能檢測(cè)系統(tǒng)(EMKA GYD-003，法國(guó))；真空冷凍干燥機(jī)(Christ ALPHA2-4LD,德國(guó))；光學(xué)顯微鏡(Olympus DP-72，日本)。

1.2 PM2.5樣品采集

于蘭州大學(xué)某實(shí)驗(yàn)樓頂(四層)空曠地帶設(shè)置采樣點(diǎn)，利用PM2.5采樣器于2016年1月至12月進(jìn)行連續(xù)采樣，流量為10 L/min，樣品采集于玻璃纖維濾膜。處理時(shí)將收集到樣品的濾膜剪為1 cm ×1 cm的小方塊，利用去離子水將其完全浸沒(méi)，超聲波清洗儀振蕩洗脫顆粒物，震蕩三次，每次30 min。6層紗布過(guò)濾，收集濾液于培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥，顆粒物稱(chēng)重后4℃避光保存，待用[10]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所購(gòu)買(mǎi)54只6周齡SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠【生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘)2015-001】，控制動(dòng)物房?jī)?nèi)環(huán)境溫度為(20±2)℃，濕度為40%～60%，晝夜節(jié)律(12 h∶12 h)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，自由進(jìn)水及食物。

1.4 COPD大鼠模型的建立

將所有大鼠按體重進(jìn)行隨機(jī)分組，分為9組，其中6組采用熏煙聯(lián)合脂多糖法制造COPD大鼠模型，另外3組大鼠于常規(guī)飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。造模時(shí)，將6只大鼠同時(shí)置于自制熏煙箱內(nèi)，并點(diǎn)燃6只香煙(每支香煙含焦油8 mg，煙堿0.9 mg，CO 12 mg)，持續(xù)1 h，熏煙期間隨時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠狀態(tài)并進(jìn)行記錄。每周進(jìn)行6 d熏煙，并在第7日行脂多糖氣管滴注，整個(gè)造模過(guò)程持續(xù)9周[11]。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù)

9組實(shí)驗(yàn)組分別為常溫健康組(3組，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+維生素E)，常溫COPD組(3組，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+維生素E)及高溫COPD組(3組，PM2.50 mg/ml，3.2 mg/ml，3.2 mg/ml+維生素E)。將PM2.5配置成3.2 mg/ml的懸液進(jìn)行氣管滴注(0.25 ml/只)，非PM2.5暴露組給予同等體積的生理鹽水滴注；維生素E配制成濃度為20 mg/ml的溶液，按40 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射干預(yù)，待PM2.5及維生素E干預(yù)完畢后，行8 h/d高溫(40℃)暴露，并選擇20℃作為常溫對(duì)照，持續(xù)3 d。模擬高溫、PM2.5染毒及維生素E末次處理后進(jìn)行大鼠肺功能檢測(cè)，分別測(cè)定大鼠平靜狀態(tài)下的最大吸氣流量(peak inspiratory flow, PIF)和最大呼氣流量(peak expiratory flow, PEF)。

1.6 生物標(biāo)本采集和檢測(cè)

末次染毒24 h后進(jìn)行大鼠麻醉，處死大鼠，取新鮮右肺上葉，迅速轉(zhuǎn)移至4%多聚甲醛固定。摘取新鮮右肺中葉，使用0.9%生理鹽水制作10%肺組織勻漿，3 000 r/min離心15 min后收集上清，轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱儲(chǔ)存，待檢。

1.6.1 肺組織病理 利用4%多聚甲醛固定右肺上葉組織24 h后，制作HE染色的肺組織病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。

1.6.2 炎性及氧化指標(biāo)檢測(cè) 肺組織MCP-1和TNF-α檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，iNOS采用比色法進(jìn)行檢測(cè)，所有檢測(cè)過(guò)程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重及行為學(xué)變化

造模期間，記錄健康組大鼠及模型組大鼠的體重變化，結(jié)果如圖1所示。在造模前，各組大鼠體重相仿，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，精神及日常行為正常。隨著造模過(guò)程的推進(jìn)，模型組大鼠行為活動(dòng)減少，攝食量降低，精神狀態(tài)不佳，伴隨明顯喘息等呼吸系統(tǒng)癥狀，造模結(jié)束后，模型大鼠體重低于健康大鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig.1Body weight changes of rats during COPD modelling

2.2 大鼠的肺功能檢測(cè)

肺功能檢測(cè)結(jié)果如表1所示，與常溫健康生理鹽水組相比，常溫及高溫COPD各組的PIE和PEF均顯著降低(P<0.05)，提示由于實(shí)驗(yàn)因素致使大鼠肺功能減退；而維生素E干預(yù)對(duì)肺功能的改善并無(wú)明顯效應(yīng)。

Tab.1Results of lung function of rats in different intervention groups (n=6)

GroupPIF (ml/s)PEF (ml/s)NH PM2.5 0 mg/ml48.33±3.2529.13±2.89 PM2.5 3.2 mg/ml36.43±1.28?24.48±2.51? PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E26.35±2.30?17.86±2.52?NC PM2.5 0 mg/ml37.50±2.25?26.12±2.57? PM2.5 3.2 mg/ml32.06±1.06?21.83±1.55?# PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E35.03±1.17?22.21±1.37?HC PM2.5 0 mg/ml8.54±1.20?6.43±1.73? PM2.5 3.2 mg/ml6.93±0.91?5.80±1.49? PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E8.34±1.04?6.74±1.59?

NH: Normal temperature health group; NC: Normal temperature COPD group; HC: High temperature COPD group

*P<0.05vsNH + saline group;#P<0.05vsNC + saline group

2.3 大鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)

圖2所示為各組大鼠肺組織病理改變?？梢?jiàn)常溫健康生理鹽水組肺組織結(jié)構(gòu)基本正常，而PM2.5暴露組中，可見(jiàn)肺泡中顆粒物沉積聚集，炎性浸潤(rùn)明顯，尤其是在COPD組中，肺泡數(shù)量減少、肺泡融合，肺大泡形成，提示COPD組大鼠肺組織損傷更嚴(yán)重。高溫刺激下，各組大鼠的肺組織中出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及大量塵細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管上皮增生。

2.4 肺組織TNF-α、MCP-1及iNOS水平的檢測(cè)

表2所示為各組大鼠肺組織勻漿中TNF-α、MCP-1及iNOS水平變化。在常溫健康組與高溫COPD組中，維生素E干預(yù)均顯著降低了TNF-α在肺組織勻漿中的水平(P<0.05)；與常溫健康生理鹽水組相比，各PM2.5干預(yù)組中MCP-1水平均有顯著提高(P<0.05)，使用維生素E干預(yù)后，相比于對(duì)應(yīng)的PM2.5干預(yù)組，MCP-1水平顯著降低，提示了維生素E的效果；高溫組各組中iNOS活性均顯著增高(P<0.05)，維生素E可顯著降低由于高溫與PM2.5暴露引起的COPD大鼠肺組織勻漿中iNOS活性的升高(P<0.05)。

Tab.2Levels of TNF-α, MCP-1 and iNOS in lung tissues of different groups (n=6)

GroupTNF-α (pg/ml)MCP-1 (pg/ml)iNOS (U/mgprot)NH PM2.5 0 mg/ml1607.67±177.5619.15±3.340.20±0.03 PM2.5 3.2 mg/ml1875.88±537.9324.65±2.15?0.24±0.05 PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1309.95±134.04△17.19±1.58△0.16±0.04NC PM2.5 0 mg/ml1456.87±360.8224.56±3.72?0.32±0.04? PM2.5 3.2 mg/ml1658.36±298.6626.47±1.70?0.31±0.04 PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1257.86±153.5618.47±2.71#●0.24±0.02HC PM2.5 0 mg/ml1670.36±242.5323.39±2.30?0.45±0.11? PM2.5 3.2 mg/ml1707.03±174.3025.23±3.02?0.54±0.15? PM2.5 3.2 mg/ml+vitamin E1295.42±126.24○18.81±2.41▲○0.37±0.03?○

NH: Normal temperature health group; NC: Normal temperature COPD group; HC: High temperature COPD group

*P<0.05vsNH+saline group;#P<0.05vsNC+saline group;▲P<0.05vsHC+saline group;△P<0.05vsNH+PM2.53.2 mg/ml group;●P<0.05vsNC+PM2.53.2 mg/ml group;○P<0.05vsHC+PM2.53.2 mg/ml group

3 討論

流行病學(xué)研究表明，高溫及大氣污染物對(duì)人群健康會(huì)產(chǎn)生協(xié)同影響。Chen等人在歐洲八個(gè)城市的研究表明每日自然總死亡率和心血管死亡率與空氣污染之間的關(guān)系受到氣溫的影響[12]；Tian等人的一項(xiàng)研究表明在高溫條件下，PM10對(duì)女性及老年人的效應(yīng)更強(qiáng)[13]；一項(xiàng)來(lái)自臺(tái)灣的研究表明在氣溫較高時(shí)，PM2.5對(duì)老年人COPD相關(guān)急診入院率 (65-79歲)影響最大[14]。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高溫可能抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活性，觸發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)而加劇PM2.5的毒性作用[7]。本研究選擇高溫?zé)崂思癙M2.5聯(lián)合暴露，結(jié)果表明二者聯(lián)合暴露可導(dǎo)致COPD大鼠肺功能明顯降低，各指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果提示PM2.5與高溫?zé)崂吮┞都せ盍舜笫篌w內(nèi)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，維生素E干預(yù)后有一定的改善。

MCP-1是由MCP-1基因編碼的一種蛋白質(zhì)，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等可在某些刺激因素作用下分泌MCP-1[15]。本研究中，健康及COPD大鼠在PM2.5與高溫暴露下，MCP-1水平顯著上升，提示MCP-1可能參與肺組織病理改變過(guò)程。病理切片顯示各組大鼠均有不同程度的肺泡融合及炎性滲出，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，支氣管上皮增生明顯，其可能機(jī)制為MCP-1作為一種炎性因子，對(duì)單核/巨噬細(xì)胞具有特異性趨化激活作用，可誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞進(jìn)入炎性部位，產(chǎn)生一系列反應(yīng)，加重肺組織內(nèi)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。而當(dāng)肺組織損傷后，巨噬細(xì)胞可聚集到損傷組織周?chē)⒈患せ?，釋放大量TNF-α，進(jìn)一步誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞聚集，分泌大量MCP-1，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)[16]。

iNOS在生理狀態(tài)下不表達(dá)，但受感染、炎癥等病理刺激后可高表達(dá)于肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中[17]，高溫組各組iNOS活性均顯著增高。而iNOS可催化合成大量NO，NO有氧自由基活性，可通過(guò)多種途徑損害細(xì)胞，參與DNA損傷，導(dǎo)致細(xì)胞炎癥。

維生素E是一種重要的抗氧化劑，其與體內(nèi)其他抗氧化劑的聯(lián)合作用可有效保護(hù)機(jī)體。陳業(yè)文等人的研究表明維生素E對(duì)較高劑量PM2.5暴露后的小鼠巨噬細(xì)胞起著一定的保護(hù)作用[18]；同樣，杜喜浩等人的研究也表明補(bǔ)充維生素E可以通過(guò)提高抗氧化物酶SOD及GSH-Px的活性進(jìn)而改善心肺系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[19]。在本研究中，在常溫健康組與高溫COPD組中，高溫維生素E干預(yù)組中iNOS活性降低，表明維生素E可以減少NO等具有氧自由基活性物質(zhì)生成；田程遠(yuǎn)等人的研究表明PM2.5染毒可引起大鼠肺部的炎性損傷，可能與肺部氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路的激活相關(guān)[20]，即氧化應(yīng)激能啟動(dòng)并加劇炎癥反應(yīng)，可推測(cè)過(guò)多的ROS可以上調(diào)與炎癥有關(guān)的基因產(chǎn)物如MCP-1等的表達(dá)，而由于維生素E對(duì)于氧自由基活性的抑制，降低了TNF-α及MCP-1在肺組織中的表達(dá)，從而降低氧化應(yīng)激和炎癥水平。

綜上所述，高溫與PM2.5可引起并進(jìn)一步加重COPD大鼠的炎癥反應(yīng)，而維生素E干預(yù)可改善高溫和PM2.5對(duì)COPD大鼠呼吸系統(tǒng)的影響。