王芳，肖雷，朱沛，朱建波

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.開遠(yuǎn)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 開遠(yuǎn) 661600)

藍(lán)舌病是由藍(lán)舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)引起的一種通過(guò)媒介昆蟲庫(kù)蠓傳播的非接觸性病毒性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報(bào)告的多種動(dòng)物共患傳染病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病[1]。BTV 屬于呼腸弧病毒環(huán)狀病毒屬病毒，目前已確認(rèn)存在至少27 種血清型[2，3]，其中，BTV-8(藍(lán)舌病歐洲8型)近年來(lái)曾在比利時(shí)、荷蘭、法國(guó)、德國(guó)等歐洲國(guó)家暴發(fā)，引起綿羊和牛大量發(fā)病，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)自1979 年在云南省師宗縣首次分離出BTV[4]后，至今在全國(guó)范圍內(nèi)已分離到11 個(gè)血清型的BTV 毒株[5]，在我國(guó)31個(gè)省(市、自治區(qū))都發(fā)現(xiàn)有藍(lán)舌病抗體陽(yáng)性動(dòng)物。為進(jìn)一步了解2018年藍(lán)舌病在我國(guó)的流行分布情況，對(duì)來(lái)自重慶、新疆、吉林、湖北、內(nèi)蒙古、貴州、河北、廣西和云南等9個(gè)省(市、自治區(qū))93個(gè)縣(市、區(qū)、旗)的牛羊血清進(jìn)行藍(lán)舌病C-ELISA抗體檢測(cè)及BTV-8型中和抗體檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 血清樣本來(lái)源

血清樣品由各省(市、自治區(qū))的動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)采集，送云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-20℃保存。樣品采集情況見表1。

1.2 試驗(yàn)試劑

BTV C-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒、BTV-8標(biāo)準(zhǔn)株均由云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院熱帶亞熱帶動(dòng)物病毒病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 BTV C-ELISA試驗(yàn)方法

在ELISA板中每孔分別加入10μL的待測(cè)血清、陽(yáng)性血清、弱陽(yáng)性血清、陰性血清(每份加2孔)，置37℃溫育30min；用試劑盒提供的樣品稀釋液按照1:100倍稀釋兔抗BTV抗體 (競(jìng)爭(zhēng)抗體)，每孔加50μL競(jìng)爭(zhēng)抗體，在37℃溫箱里溫育60min；用PBST洗液洗板2次，拍干，按1:1000稀釋羊抗兔IgG-HRP酶標(biāo)抗體，每孔加50μL，在37℃溫箱里溫育30min；用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50μL底物反應(yīng)液，37℃避光溫育10min，每孔加入終止液50μL終止反應(yīng)，15min內(nèi)在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)下讀取OD值。結(jié)果判定：抑制率(PI)=(陰性對(duì)照OD450平均值-樣品血清OD450) / 陰性對(duì)照OD450平均值×100%,抑制率≥50%時(shí)判為抗體陽(yáng)性，否則為陰性。

1.4 BTV-8標(biāo)準(zhǔn)毒株毒價(jià)測(cè)定

96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100μL，將病毒按100-10-10倍比稀釋，依次加入96孔板中，每孔加50μL，每個(gè)稀釋度做8孔，吸附1h后，接毒孔中加入50μL維持液，剩余對(duì)照孔中加入100μL維持液，37℃培養(yǎng)5d，觀察細(xì)胞病變的情況，用Reed and Mench法計(jì)算毒價(jià)。

1.5 微量中和試驗(yàn)

將C-ELISA陽(yáng)性的待檢血清做1:10倍稀釋來(lái)中和100個(gè)TCID50的病毒，存在中和作用時(shí)，再對(duì)這些血清進(jìn)一步稀釋為1:20和1:40做微量中和試驗(yàn)，中和滴度大于1:40的判定為陽(yáng)性。

表1 血清樣本采樣地點(diǎn)及數(shù)量統(tǒng)計(jì)表

2 結(jié)果

2.1 BTV C-ELISA結(jié)果

圖1 各省(市、自治區(qū))BTV血清抗體陽(yáng)性率比較

對(duì)5 721份血清樣本進(jìn)行BTV C-ELISA抗體檢測(cè)，其中1769份血清樣本為BTV抗體陽(yáng)性，平均陽(yáng)性率為30.92%，被調(diào)查的省份均檢出BTV抗體陽(yáng)性樣品，結(jié)果見表2。其中，以云南省的抗體陽(yáng)性率最高，達(dá)75.90%，吉林省的陽(yáng)性率最低，僅為4.33%，各省(市、自治區(qū))陽(yáng)性率差異明顯，見圖1。在所檢測(cè)的樣品中，云南的樣品全是牛血清樣品，其他省、市、自治區(qū)牛和羊血清樣品都有，合計(jì)檢測(cè)牛血清樣品1827份，陽(yáng)性率為44.12%，羊血清樣品3894份，陽(yáng)性率為23.73%，各省(市、自治區(qū))牛、羊血清樣品BTV抗體檢測(cè)結(jié)果見表3。

表2 血清樣本BTV C-ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 中和試驗(yàn)定型

將1769份BTV抗體陽(yáng)性的血清做微量中和試驗(yàn)，其中有1540份作1:10倍稀釋時(shí)有中和作用，將這1540份血清進(jìn)一步稀釋為1:20、1:40再次進(jìn)行微量中和試驗(yàn)，這1540份血清對(duì)BTV-8均無(wú)中和保護(hù)，全判定為BTV-8抗體陰性。

3 討論

BTV 主要通過(guò)庫(kù)蠓吸血傳播，其分布受庫(kù)蠓活動(dòng)影響極大。庫(kù)蠓孳生于水塘、沼澤、湖泊附近的草叢、樹林、洞穴等避風(fēng)、避光潮濕處。庫(kù)蠓活動(dòng)常常受環(huán)境因素的影響，特別是溫度、濕度、降雨量等，有明顯的季節(jié)性和地域性[6]。

表3 牛、羊血清樣品BTV C-ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果

通過(guò)對(duì)2018年我國(guó)9個(gè)省(市、自治區(qū))93個(gè)縣(市、區(qū)、旗)牛、羊血清樣品進(jìn)行BTV C-ELISA抗體檢測(cè)，平均陽(yáng)性率高達(dá)30.92%。在9個(gè)省(市、自治區(qū))都檢出抗體陽(yáng)性樣品，在93個(gè)縣(市、區(qū)、旗)檢出陽(yáng)性樣品，表明BTV在我國(guó)的感染已相當(dāng)普遍，這與我國(guó)庫(kù)蠓種類多、分布廣泛相對(duì)應(yīng)。

此次云南省樣品的BTV抗體陽(yáng)性率高達(dá)75.90%，與這些樣品均來(lái)源于云南南部與緬甸、老撾和越南接壤的10個(gè)邊境縣，而且全部是牛血清樣品密切相關(guān)。云南的南部緯度低，氣候高熱高濕，適宜庫(kù)蠓的生存、繁殖，庫(kù)蠓活動(dòng)頻繁。同處低緯度具有相似氣候特點(diǎn)的廣西的牛血清樣品的抗體陽(yáng)性率也高達(dá)75%。

我國(guó)北方的河北、內(nèi)蒙古和吉林等地樣品的BTV抗體陽(yáng)性率都不到10%，與這些地方緯度較高、冬季嚴(yán)寒漫長(zhǎng)、年均氣溫低、庫(kù)蠓活動(dòng)受限有關(guān)。

新疆樣品的BTV抗體陽(yáng)性率也較高，其中牛的陽(yáng)性率為35.23%，羊的陽(yáng)性率為41.68%，這是一個(gè)值得重視的情況。新疆位于亞歐大陸深處，雖然大部分地區(qū)常年降雨量小，冬季寒冷，夏季炎熱，不利于庫(kù)蠓的生存繁殖。但新疆地域廣闊，除有大面積的沙漠戈壁等不利于庫(kù)蠓生存的環(huán)境外，也有一些森林、草原和濕地為庫(kù)蠓提供了繁衍生息所需的適宜條件，這些地方也是主要的牛羊放牧場(chǎng)所，為BTV的傳播提供了良好條件。

本研究對(duì)我國(guó)多地的牛羊進(jìn)行了BTV血清學(xué)調(diào)查，覆蓋我國(guó)不同氣候類型地區(qū)，樣本量較大，較好的反映了2018年度藍(lán)舌病在中國(guó)的分布情況，為該病的防控提供了流行病學(xué)依據(jù)。