吳海寧 黃志鵬 唐秀梅 熊發(fā)前 鐘瑞春 賀梁瓊 韓柱強 蔣菁 劉菁 唐榮華

摘要：設(shè)置施氮N3（64 kg/hm2）、減量施氮N2（51 kg/hm2）、減量施氮N1（34 kg/hm2），不施氮N0共4個施氮水平，對花生單作、玉米花生間作體系中花生根際土壤樣品運用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)測序并分析固氮微生物的多樣性。結(jié)果表明，在單作花生根際土中固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施表現(xiàn)出升高的趨勢，而在間作花生根際土中固氮微生物的多樣性和豐度則隨著氮肥的減施出現(xiàn)降低的趨勢。對24個花生根際土壤樣品進行測序分析得到，固氮微生物可操作分類單元（OTUs）在分類學(xué)門、科和屬水平上可歸類為8個門、29個科和37個屬，其中在門水平上有3個優(yōu)勢類群，共占所有門的97.7%以上，分別為變形菌門（Proteobacteria）、細菌未分類門（p_unclassified_k_，norank_d_Bacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）。氮肥減施條件下固氮微生物群落結(jié)構(gòu)在單作花生根際土壤中比較相似，在間作花生根際土壤差異較大。試驗表明，氮肥減施有利于單作花生根際土壤固氮微生物的生長，增強固氮微生物相對土壤中其他微生物的競爭優(yōu)勢，提高固氮微生物的多樣性和豐度。而氮肥減施不利于間作花生根際土壤固氮微生物的生長繁殖，降低了間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度。

關(guān)鍵詞：氮肥減施;花生根際土;固氮微生物;多樣性

中圖分類號： S154.3 ?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0093-04

收稿日期：2018-05-07

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：31660371）;廣西科技開發(fā)項目（編號：桂科轉(zhuǎn)1599004-12）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金（編號：CARS-13-華南區(qū)栽培）;廣西自然科學(xué)基金（編號：2017GXNSFAA198144）;廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（編號：桂農(nóng)科2017JM18）。

作者簡介：吳海寧（1986—），男，廣西扶綏人，碩士，助理研究員，主要從事花生栽培與育種研究工作。

通信作者：唐榮華，博士，研究員，主要從事花生高產(chǎn)高效栽培與育種研究工作。

氮素是植物不可或缺的營養(yǎng)元素，是提高作物產(chǎn)量的重要限制因子。但是過量施用氮肥會對土壤環(huán)境造成損害，也會對農(nóng)田土壤微生態(tài)造成影響。近年來人們開始關(guān)注氮肥的施用以及土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和循環(huán)。生物固氮是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中土壤氮素的有效來源之一[1]，土壤中的固氮微生物能夠?qū)⒖諝庵械腘2還原成NH3供植物根系吸收，是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的主要途徑之一[2]。土壤固氮微生物是根際土壤環(huán)境的重要組成部分，其群落多樣性可以反映土壤微生態(tài)的代謝方式和生理功能[3]，群落結(jié)構(gòu)組成能影響氮素循環(huán)的平衡與土壤氮素的固定，在土壤氮素循環(huán)中起著重要作用。因此研究氮肥減施和不同種植模式下土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)差異，對建立合理的種植模式和土壤氮素循環(huán)利用具有重要意義。

花生是我國重要的油料作物與經(jīng)濟作物，是食用油和蛋白質(zhì)的來源。為滿足消費需求，我國花生的種植面積、規(guī)模、產(chǎn)量持續(xù)增長，同時也消耗了大量的化學(xué)肥料，影響土壤微生態(tài)環(huán)境。為可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)，減少對農(nóng)業(yè)化學(xué)氮肥的依賴，花生與禾本科間作體系正越來越受到關(guān)注[4]。間作能增加農(nóng)田生物的多樣性和穩(wěn)定性，提高土壤微生物量，改善農(nóng)田土壤生態(tài)，促進農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)平衡[5]，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要栽培模式。

土壤固氮微生物含有編碼固氮酶蛋白的nifH基因，該基因與16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育有著顯著的相似性[6]，可以作為分子生物學(xué)研究土壤固氮微生物的靶標[7]。已有學(xué)者利用分子生物學(xué)方法對土壤、海洋、河流等生態(tài)環(huán)境進行研究，結(jié)果表明，不同的生態(tài)環(huán)境中含有固氮酶nifH基因的微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)具有顯著的差異[8]。目前對單、間作花生在氮肥減施條件下根際土壤固氮微生物的研究鮮有報道。因此，本研究利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)，探討氮肥減施對單、間作花生根際土壤固氮微生物多樣性及群落組成的影響，以期為花生生產(chǎn)中氮肥減施及花生與禾本科間作體系研究提供土壤固氮微生物方面的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的花生品種為桂花836、玉米品種為桂單0810。供試地點土壤理化性質(zhì)：全氮、全磷、全鉀含量分別為0.113%、0.053%、0.240%，水解性氮含量為88 mg/kg，有效磷含量為11.4 mg/kg，速效鉀含量為110 mg/kg，有機質(zhì)含量為 18.5 g/kg，pH值為7.1。

1.2 試驗方案

試驗于2017年3月在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院武鳴里建科學(xué)研究基地進行，采用裂區(qū)設(shè)計，主區(qū)為種植模式，分別為花生單作、玉米花生間作，副區(qū)為花生施氮總量，共設(shè)置4個不同施氮水平，分別為常規(guī)施氮N3（64 kg/hm2），減量施氮N2（51 kg/hm2），減量施氮N1（34 kg/hm2），不施氮N0（對照），共8個處理，3次重復(fù)，每個小區(qū)面積為40 m2。每小區(qū)花生還需施用P2O5 67.5 kg/hm2、K2O 67.5 kg/hm2以及鈣鎂磷肥750 kg/hm2，玉米施肥模式為450 kg/hm2復(fù)合肥（N ∶P2O5 ∶K2O 含量百分比為15 ∶15 ∶15）作基肥，300 kg/hm2 復(fù)合肥和150 kg/hm2尿素（N含量為46%）作追肥。玉米、花生均采用寬窄行種植，規(guī)格相同，大行距55 cm，小行距35 cm，玉米株距為0.2 m，每穴1株，花生穴距為 0.16 m，每穴2株。間作采用4行玉米、6行花生的種植模式。

1.3 根際土壤樣品的采集

于花生莢果膨大期采集各處理小區(qū)的花生根際土壤。將處理小區(qū)的花生植株拔起，輕輕抖落根部的表土后，用無菌毛刷將附著在根系表面1～4 mm的土壤刷入無菌離心管中，每小區(qū)取3份根際土壤，混合后作為該小區(qū)的根際土壤樣品，保存于-80°冰箱，用于固氮微生物多樣性的分析。

1.4 土壤固氮微生物多樣性分析

1.4.1 土壤總DNA提取及PCR擴增

取0.5 g土壤樣品，使用MP Bio公司生產(chǎn)的土壤基因組DNA提取試劑盒（FastDNA Spin Kit For Soil）進行土壤樣品總DNA的提取與純化，DNA濃度和純度利用超微量分光光度計（Nano Drop2000）進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

選用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）引物nifHF（5′-AAAGGYGGWATCGGYAARTCCACCAC-3′）和nifHR（5′-TTGTTSGCSGCRTACATSGCCATCAT-3′）對nifH基因進行擴增，體系為DNA聚合酶緩沖液（5×FastPfu）4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，10 ng DNA模板，補雙蒸水（ddH2O）至20 μL。擴增程序：95 ℃ 預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min（PCR儀為ABI GeneAmp?9700型）。

1.4.2 Illumina Miseq測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA凝膠回收試劑盒進行純化，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測;利用微型熒光計（QuantiFluorTM-ST）進行定量檢測。根據(jù)高通量測序（Illumina MiSeq）平臺標準操作規(guī)程對純化后的擴增片段構(gòu)建文庫。

利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序（委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序）。

1.4.3 數(shù)據(jù)處理

原始測序序列使用Trimmomatic軟件進行質(zhì)控，并用FLASH軟件進行拼接;使用UPARSE軟件（版本：version 7.1，網(wǎng)址：http：//drive5.com/uparse/）根據(jù)97%的相似度對序列進行分類單元（OTU）聚類;使用UCHIME軟件剔除嵌合體。利用核糖體數(shù)據(jù)庫項目（RDP）分類器（網(wǎng)址：http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，與FGR數(shù)據(jù)庫中的固氮酶基因（nifH）進行比對，設(shè)置比對閾值為70%;運用I-Sanger生信云平臺（網(wǎng)址：http：//www.i-sanger.com/）進行樣本內(nèi)多樣性（Alpha）和樣本間多樣性（Beta）計算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果質(zhì)量分析

運用高通量測序技術(shù)對24個花生根際土壤樣品里的固氮微生物nifH基因進行測序分析，并對原始測序序列進行過濾、雙端拼接，共獲得優(yōu)化序列347 174條，序列的平均長度為 430.67 bp。將優(yōu)化序列按照97%相似性對非重復(fù)序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，共得到OTU的代表序列1 228條，各土壤樣品相關(guān)測序數(shù)據(jù)如表1所示。

稀釋性曲線（rarefaction curve）通過序列數(shù)與物種數(shù)來構(gòu)建，可以用于驗證測序數(shù)據(jù)量是否足以反映樣品中的物種多樣性，也可以用來說明樣本的測序數(shù)據(jù)量是否足以覆蓋所有類群。從圖1可以看出，各樣品的序列數(shù)據(jù)量達到7 000條時，可操作單元數(shù)基本趨于飽和，表明測序獲得了足夠多的數(shù)據(jù)量，而且從表1可知，各樣品測序覆蓋度都在0.95以上，基本可以反映各土壤樣品中固氮微生物的信息。

2.2 各樣品中固氮微生物多樣性指數(shù)分析

Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)常用來衡量樣品中微生物物種豐度即物種數(shù)量的多少，是生態(tài)學(xué)中估計物種總數(shù)的常用指數(shù)。Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)常用于衡量樣品中微生物物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，則說明樣品中微生物群落多樣性越高。從表2可以看出，單作花生N0、N1處理的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)均分別大于N2、N3處理，單作花生N0、N1處理的Simpson指數(shù)均分別小于N2、N3處理，大體上看，單作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施基本上呈現(xiàn)出升高的趨勢;除了Ace指數(shù)外，間作花生N0、N1處理的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)均分別小于N2、N3處理，間作花生N0、N1處理的Simpson指數(shù)均分別大于N2、N3處理，大體上看，間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度隨著氮肥的減施大致出現(xiàn)降低的趨勢。說明在栽培單作花生時，減施氮肥能提高花生根際土壤的固氮微生物多樣性和豐度，而間作花生則相反。

2.3 不同花生根際土壤固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)分析

24個花生根際土壤樣品經(jīng)測序檢測得到，固氮微生物OTUs在分類學(xué)門、科和屬水平上可歸類為8個門、29個科和37個屬。其中變形菌門（Proteobacteria）、細菌未分類門（p_unclassified_k_norank_d_Bacteria）、藍藻門（Cyanobacteria）是門水平上的3個優(yōu)勢類群，其占比之和大于97.7%（圖2）。在屬分類水平上平均豐度大于1%的有16個屬，其中主要的優(yōu)勢類群有變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、根瘤菌目未分類屬（unclassified_o_Rhizobiales）、α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、細菌未分類屬（unclassified_k_norank_d_Bacteria）、地桿菌屬（Geobacter）、厭氧黏細菌屬（Anaeromyxobacter）、三離藻屬（Trichormus）、產(chǎn)堿菌屬（Azohydromonas）9個，其在所有土壤樣品中平均相對豐度分別為35.4%、13.2%、11.1%、8.7%、7.9%、6.3%、3.6%、3.3%、1.5%（圖3）。

在單作花生的根際土壤中，變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、厭氧黏細菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施表現(xiàn)出先降低后再升高的趨勢，均在N2水平下達到最低值。α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、地桿菌屬的相對豐度值均隨著氮肥的減施呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，前者達到最高值時在N2水平，后者則在N1水平。根瘤菌目未分類屬（unclassified_o_Rhizobiales）的相對豐度值無明顯的變化規(guī)律。慢生根瘤菌屬的相對豐度值受氮肥減施影響不大。

在間作花生的根際土壤中，變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、根瘤菌目未分類屬（unclassified_o_Rhizobiales）、α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、厭氧黏細菌屬的相對豐度值是隨著氮肥的減施均呈現(xiàn)出先降低后再升高的趨勢，且都在N2水平下達到最低值。慢生根瘤菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施總體升高，在N0水平下達到最高值。地桿菌屬、三離藻屬的相對豐度值隨氮肥的減施表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。

在單、間作花生根際土壤中變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、厭氧黏細菌屬的相對豐度值隨著氮肥的減施其變化規(guī)律基本一致。氮肥減施對單作花生根際土壤中慢生根瘤菌屬的相對豐度值影響不大，但其能提高間作花生根際土壤慢生根瘤菌屬的相對豐度值。

2.4 不同土壤樣品固氮微生物的Venn圖分析

由圖4可知，在單作花生根際土壤中，單作花生N3、單作花生N2、單作花生N1和單作花生N0處理的總操作分類單元（OTU）數(shù)分別為839、767、961、911個，其共同包含的OTU有519個。單作花生N3特有的OTU數(shù)為32個，單作花生N2特有的OTU數(shù)為25個，單作花生N1特有的OTU數(shù)為61個和單作花生N0特有的OTU數(shù)為33個。從結(jié)果可以看出，不同施氮水平下的單作花生根際土壤所含的OTU數(shù)單作花生N1和單作花生N0分別大于單作花生N3和單作花生N2，說明單作花生氮肥減施可以提高其根際土壤中的固氮微生物類群數(shù)量。

在氮肥減施的間作花生根際土壤中，其共同包含的OTU有447個，間作花生N3、間作花生N2、間作花生N1和間作花生N0處理OTU數(shù)分別為902、857、891和738個。間作花生N3特有的OTU數(shù)為47個，間作花生N2特有的OTU數(shù)為31個，間作花生N1特有的OTU數(shù)為31個和間作花生N0特有的OTU數(shù)為37個。由此可以得出，不同施氮水平的間作花生根際土壤所含的OTU數(shù)間作花生N3和間作花生N2分別大于間作花生N1和間作花生N0，說明間作花生氮肥減施使其根際土壤中的固氮微生物類群數(shù)量減少。

2.5 不同土壤樣品固氮微生物的群落結(jié)構(gòu)的相似性分析

采用主坐標分析方法對8個不同處理組的花生根際土壤固氮微生物在屬分類水平上進行分析，評估固氮微生物群落間的差異。從圖5可以看出，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對固氮微生物群落結(jié)構(gòu)變異的解釋量分別為70.70%和12.03%;單作花生根際土壤樣品間的點距離比較近，說明它們的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)比較相似;而間作花生的根際土壤樣品點比較分散，樣品間距離較遠，說明其根際土壤間的固氮微生物群落的構(gòu)成差異較大。

3 結(jié)論與討論

土壤固氮微生物是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中參與土壤氮素循環(huán)利用的重要功能菌群，其群落結(jié)構(gòu)的多樣性對農(nóng)田土壤微生態(tài)氮素的固持和循環(huán)利用具有重要的意義[9]。大量研究表明，農(nóng)田長期施用氮肥會使得土壤固氮微生物的競爭力下降，從而導(dǎo)致其群落結(jié)構(gòu)、組成和多樣性的改變[10-12]。鄭棉海等研究得出，土壤氮素含量變化會對固氮微生物與其他土壤微生物的競爭關(guān)系產(chǎn)生影響，同時也指出，在氮素缺乏的土壤中固氮微生物更具有競爭優(yōu)勢[13]。本研究表明，減施氮肥能提高單作花生根際土壤的固氮微生物多樣性和豐度，提高其根際土壤固氮微生物類群數(shù)量，有利于固氮微生物的生長，這與周晶的研究結(jié)論相似：土壤施加氮肥會使固氮微生物的數(shù)量顯著降低，并且氮肥水平越高，固氮微生物的數(shù)量越低[14]。而間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度則隨著氮肥減施量的增加呈降低趨勢，使根際土壤固氮微生物類群數(shù)量減少。導(dǎo)致單、間作花生根際土壤固氮微生物多樣性和豐度隨氮肥減施產(chǎn)生相反變化趨勢的原因可能是，間作栽培體系比單作需要更多的氮肥來保證作物正常生長，而氮肥減施會減少土壤固氮微生物生長所需的營養(yǎng)，不利于微生物繁殖，同時間作栽培體系也改變了間作花生根際的土壤微生態(tài)環(huán)境，使得間作花生根際土壤溫度、濕度等環(huán)境因子以及固氮微生物可以利用的碳氮營養(yǎng)、礦質(zhì)元素發(fā)生了變化。

在本研究中，氮肥減施對單、間作花生根際土壤中的固氮微生物群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性的影響并不完全一致。隨著氮肥的減施兩者中的變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、厭氧黏細菌屬的固氮微生物相對豐度值變化規(guī)律基本一致。氮肥減施對單作花生根際土壤中慢生根瘤菌屬的相對豐度值影響不大，但其能提高間作花生根際土壤慢生根瘤菌屬的相對豐度值。與單作花生根際土壤相比，間作花生根際土壤的地桿菌屬（Geobacter）、三離藻屬（Trichormus）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium ）的平均相對豐度分別提高了7.1%、2.9%、1.9%，變形菌門未分類屬（unclassified_p_Proteobacteria）、α-變形菌綱未分類屬（unclassified_c_Alphaproteobacteria）、根瘤菌目未分類屬（unclassified_o_Rhizobiales）的平均相對豐度分別降低了 5.1%、3.3%、2.3%。

氮肥減施有利于單作花生根際土壤固氮微生物的生長，能夠提高固氮微生物相對土壤中其他微生物的競爭優(yōu)勢，同時可提高了固氮微生物的多樣性和豐度。而氮肥減施不利于間作花生根際土壤固氮微生物的生長繁殖，降低了間作花生根際土壤固氮微生物的多樣性和豐度。

參考文獻：

[1]Zou Y K，Zhang J N，Yang D L，et al. Effects of different land use patterns on nifH genetic diversity of soil nitrogen-fixing microbial communities in Leymus Chinensis steppe[J]. Acta Ecologica Sinica，2011，31（3）：150-156.

[2]馮曉敏，楊 永，任長忠，等. 燕麥/大豆和燕麥/花生間作對根際土壤固氮細菌多樣性與群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2016，21（1）：22-32.

[3]彭東海，楊建波，李 健，等. 間作大豆對甘蔗根際土壤細菌及固氮菌多樣性的影響[J]. 植物生態(tài)學(xué)報，2014，38（9）：959-969.

[4]楊亞東，馮曉敏，胡躍高，等. 豆科作物間作燕麥對土壤固氮微生物豐度和群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2017，28（3）：957-965.

[5]Zhu Y Y，Chen H R，F(xiàn)an J H，et al.Genetic diversity and disease control in rice[J]. Nature，2000，406：718-722.

[6]Young J P W，Stacy G，Burris R H，et al.Biological nitrogen fixation phylogenic classification of nitrogen-fixing organisms[M]. New York：Chapman and Hall，1992：43-86.

[7]Raymond J，Siefert J L，Staples C R，et al.The natural history of nitrogen fixation[J]. Molecular Biology and Evolution，2004，21（3）：541-554.

[8]Zehr J P，Jenkins B D，Short S M，et al . Nitrogenase gene diversity and microbial community structure：a cross-system comparison[J]. Environmental Microbiology，2003，5（7）：539-554.

[9]Dixon R，Kahn D.Genetic regulation of biological nitrogen fixation[J]. Nature Reviews Microbiology，2004（2）：621-631.

[10]Orr C H，James A，Leifert C，et al.Diversity and activity of free-living nitrogen-fixing bacteria and total bacteria in organic and conventionally managed soils[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（3）：911-919.

[11]Mirza B S，Potisap C，Nüsslein K，et al.Response of free-living nitrogen-fixing microorganisms to land use change in the Amazon rainforest[J]. Applied and Environmental Microbiology，2014，80（1）：281-288.

[12]Wang J C，Zhang D，Zhang L，et al.Temporal variation of diazotrophic community abundance and structure in surface and subsoil under four fertilization regimes during a wheat growing season[J]. Agriculture Ecosystems & Environment，2016，216：116-124.

[13]鄭棉海，陳 浩，朱曉敏，等. 礦質(zhì)養(yǎng)分輸入對森林生物固氮的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報，2015，35（24）：7941-7954.

[14]周 晶. 長期施氮對東北黑土微生物及主要氮循環(huán)菌群的影響[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017：85-108.