劉妮妮 張靚 伍冰倩 周澤建 趙珩

摘要：禽白血病病毒（avian leukemia virus，簡稱ALV）引發(fā)的禽白血病致死率高達(dá)10%～20%，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。通過構(gòu)建TRIM39（tripartite motif 39）重組原核表達(dá)載體，分析其在抗禽白血病病毒中的作用，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測雞白血病病毒抗原，獲得細(xì)胞內(nèi)外病毒濃度變化，發(fā)現(xiàn)TRIM39、TRIM39ΔRING（RING結(jié)構(gòu)域缺失體）、TRIM39ΔB30.2（B-box結(jié)構(gòu)域缺失體）對禽白血病病毒均有一定的抑制作用，并且缺失體的抑制效果明顯更弱。研究結(jié)果提示，TRIM39參與抗禽白血病病毒的作用，且RING結(jié)構(gòu)域和B-box結(jié)構(gòu)域起著重要的作用。

關(guān)鍵詞：TRIM39;TRIM39缺失體;新型免疫分子;禽白血病病毒

中圖分類號： S852.65+7 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）16-0063-04

收稿日期：2018-04-21

基金項目：中央民族大學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項目（編號：YDZXXK201618）。

作者簡介：劉妮妮（1992—），女，湖北漢川人，碩士，主要從事免疫學(xué)研究。

通信作者：趙 珩，博士，教授，主要從事免疫學(xué)研究。

三重基序（TRIM）蛋白幾乎存在于所有多細(xì)胞動物中，是一個古老且數(shù)量龐大的蛋白家族[1]。隨著脊椎動物的進(jìn)化，TRIM蛋白種類顯著增加，迄今為止僅在人類基因組中就已發(fā)現(xiàn)近70種[2]。TRIM蛋白家族成員都擁有保守的RBCC結(jié)構(gòu)，從N端至C端依次為RING結(jié)構(gòu)域、1或2個B-box結(jié)構(gòu)域及1個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域（coil-coiled domin，簡稱CCD）[3]。這些結(jié)構(gòu)域都具備各自的功能，RING結(jié)構(gòu)域是由10～20個氨基酸組成的鋅結(jié)合序列，研究發(fā)現(xiàn)，有些TRIM蛋白能夠依賴RING結(jié)構(gòu)域發(fā)揮E3連接酶活性，如TRIM21[4]、TRIM25[5]、TRIM11[6]等;B-box結(jié)構(gòu)域同樣是鋅結(jié)合序列，目前對其功能研究還不夠清楚，但其被證實對人類免疫缺陷病毒（HIV）具有抗性，能夠影響TRIM5α對病毒的識別[7]以及TRIM15限制病毒復(fù)制的能力[8];卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域幾乎總是跟隨著B-box結(jié)構(gòu)域，它主要會影響TRIM蛋白與其他蛋白相互作用的能力[9]。另外，TRIM蛋白C端結(jié)構(gòu)域具有多樣性且在不同蛋白之間的差異較大，通常由1個或多個類型不固定的結(jié)構(gòu)域組成，根據(jù)C端結(jié)構(gòu)域的不同，TRIM蛋白還被分為11類亞家族[10]。TRIM蛋白家族具有非常廣泛的功能，參與了一系列重要的生命活動，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)控、先天性免疫調(diào)控、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控等[11]，在生物機(jī)體中發(fā)揮著越來越重要的作用。

大量研究證實，TRIM蛋白家族成員具有抗病毒活性，它們不僅能夠直接作用于病毒蛋白進(jìn)而限制病毒的復(fù)制，還能參與調(diào)節(jié)免疫信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生[12]。Stremlau等在非洲綠猴和獼猴中首次發(fā)現(xiàn)TRIM5α能夠限制Ⅰ型艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，簡稱HIV-1）的侵染[13];Hattlmann等報道TRIM21能夠與腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，簡稱EMCV）蛋白酶3C、流感病毒（influenza virus，簡稱IV）核蛋白（NP）相互作用，誘導(dǎo)蛋白發(fā)生泛素化降解以抑制病毒的復(fù)制[14];Bonilla等發(fā)現(xiàn)，腦膜炎病毒（lymphocytic choriomeningitis virus，簡稱LCMV）致死TRIM19/PML缺失的小鼠的概率更高，說明TRIM19也具有抵病毒作用[15];另外，TRIM5/6/11/14/25/26/31/41可以限制乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，簡稱HBV）啟動子增強(qiáng)劑的轉(zhuǎn)錄活性[16]。還有一些研究證明，TRIM蛋白能夠使靶蛋白發(fā)生泛素化降解或蛋白酶體降解[17-19]，從而負(fù)調(diào)控免疫信號通路，如NF-κB、TLRs、RIG-Ⅰ等[20-21]。雞馬立克氏病與?MHC-B亞區(qū)有關(guān)，通過對MHC-B亞區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)了許多TRIM基因，而且這些基因表現(xiàn)出極高的單核苷酸多態(tài)性（SNP），說明TRIM基因可能具有抗馬立克氏病的作用，但現(xiàn)在還沒有足夠的證據(jù)[22]。

禽白血病病毒（avian leukemia virus，簡稱ALV）屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae），禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，病毒粒子的直徑為80～100 nm，由外部的囊膜和內(nèi)部電子致密的核心構(gòu)成[23]，是雞群中普遍存在并常誘發(fā)腫瘤的病毒之一，其引發(fā)的禽白血病被我國政府列為二類動物疫病。根據(jù)病毒宿主范圍、囊膜特性以及交叉中和反應(yīng)的不同，可將ALV分為A～J 10個亞群[24]，其中A、B、C、D、E、J 6個亞群能夠感染雞群，在我國A、B、J亞群的感染現(xiàn)象較為普遍，它們可誘發(fā)雞群淋巴細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、髓細(xì)胞瘤、成紅細(xì)胞瘤、骨硬化、血管瘤等不同類型的腫瘤[25]，還具有破壞免疫器官、組織和細(xì)胞的能力，使機(jī)體的免疫應(yīng)答功能暫時性或永久性喪失，導(dǎo)致雞的死亡率顯著提高;另外，ALV的感染還會使雞群的生長速度變緩，體質(zhì)量增加變慢，產(chǎn)蛋率和蛋品質(zhì)下降，而且由于禽白血病病毒具有橫向及縱向傳播特點[26-27]，加上家禽養(yǎng)殖高度集約化，使該病毒引發(fā)的禽白血病很難控制，目前尚未找到有效的防控方法，這對我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以雞TRIM39為研究對象，構(gòu)建TRIM39及其缺失體的真核表達(dá)載體，以研究TRIM39抗禽白血病病毒的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物及病毒

雞脾組織（英國劍橋大學(xué)Kaufma教授提供）;禽白血病病毒（ALV）（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所張志芳研究員提供）。試驗時間為2016年8月至2018年3月;試驗地點為中央民族大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院。

1.1.2 表達(dá)載體及菌株

pDsRed2-C1真核表達(dá)載體為筆者所在實驗室保存;載體、大腸桿菌（Escherichia coli）Top10感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 酶和試劑

Trizol、Oligo-dT18、三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇、RNase抑制劑、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、96孔酶標(biāo)板、胎牛血清素、胰酶細(xì)胞消化液、D-Hanks平衡鹽溶液、禽白血病病毒檢測試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司。EasyTaq DNA聚合酶、DNA Marker、Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶，均購自NEB公司。PCR儀（Bio-Rad公司）、臺式高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）、冷凍高速離心機(jī)（美國貝克曼公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）、生化培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中雞TRIM39基因序列號（NM_001006196.3），TRIM39結(jié)構(gòu)域的生物信息學(xué)分析，利用DNAMAN對TRIM39進(jìn)行比對，確定TRIM39缺RING結(jié)構(gòu)域設(shè)計位置。利用Primer 5.0軟件，依據(jù)pEGFP-N1真核表達(dá)載體及目的基因的結(jié)構(gòu)特點，在引物上游加入Sal Ⅰ酶切位點，下游加入BamH Ⅰ酶切位點。TRIM39完整序列引物為P39F：5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39R：5′-CGGGATCCTCA-CGGGGACAGCGTGAAGCG-3′;TRIM39ΔRING序列引物為P39ΔRINGF：5′-ACGCGTCGACATGGATGAAGATAACCCAG-3′和P39ΔRINGR：5′-CGGGATTCTCACGGGGACAGCGTGAAGCG-3′，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 目的基因的獲得

利用改良Trizol法提取雞脾臟中的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，分別以P39F2/P39R2、P39ΔRINGF/P39ΔRINGR、P39ΔB30.2F/P39ΔB30.2R為引物進(jìn)行TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為50 μL，包括10×buffer（緩沖液）5 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）1.5 μL、Pfu DNA聚合酶（2 U/μL）1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 36.5 μL。反應(yīng)體系：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸3 min，共34個循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。膠回收TRIM39基因片段，與pEASY-Blunt Simple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌（Escherichia coli） Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測，篩選陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

以Sal Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切含有TRIM39的pEASY-Blunt Simple載體和 pEGFP-N1真核表達(dá)載體，分離膠純化回收目的片段。連接2個目的片段，轉(zhuǎn)化E.coli Top10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ進(jìn)行雙酶切驗證。TRIM39完整序列、TRIM39ΔRING序列以及與pDsRed2-C1真核表達(dá)載體的連接以及鑒定的具體操作方法同上。

1.2.4 雞白血病病毒抗原（ALV-AG）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）

用無菌管吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，3 000 r/min離心2 min，收集上清用以檢測細(xì)胞外病毒;用D-Hanks平衡鹽溶液洗掉殘余的細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰酶消化液將細(xì)胞懸浮起來，收集于離心管中，12 000 r/min離心2 min使細(xì)胞沉淀，棄去胰酶消化液，加入磷酸緩沖鹽溶液（PBS）重懸細(xì)胞，通過反復(fù)凍融使細(xì)胞破裂釋放出細(xì)胞內(nèi)成分，3 000 r/min離心2 min，收集上清用以檢測細(xì)胞內(nèi)病毒。采用禽白血病病毒檢測試劑盒，ELISA法測定ALV-AG，檢測細(xì)胞內(nèi)外病毒濃度，具體步驟嚴(yán)格按照惠特比科技發(fā)展（北京）有限公司提供的說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2片段的克隆

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，由圖1可知，獲得的TRIM39完整序列長度約為1 410 bp，TRIM39ΔRING序列長度約為1 241 bp，TRIM39ΔB30.2序列長度約為894 bp，與預(yù)期基因大小相符。篩選陽性克隆送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果正確，表明pEASY-Blunt Simple-TRIM39克隆載體構(gòu)建成功。

2.2 重組表達(dá)載體pDsRed2-C1-TRIM39、pDsRed2-C1-TRIM39ΔRING、pDsRed2-C1-TRIM39ΔB30.2的鑒定

使用菌落PCR法鑒定陽性重組子，由圖2可知，菌落PCR獲得條帶大小與PCR擴(kuò)增獲得的條帶大小一致，說明TRIM39及其突變體已經(jīng)構(gòu)建到pDsRed2-C1真核表達(dá)載體上并成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌。

由圖3可知，TRIM39完整序列、TRIM39缺RING突變體、TRIM39缺B30.2突變體構(gòu)建到pDsRed2-C1的菌落PCR鑒定結(jié)果，與預(yù)期一致。圖3的左圖中TRIM39缺RING突變體條帶明顯比TRIM39缺RING突變體小，說明TRIM39缺RING突變體構(gòu)建成功;圖3的右圖中2號和7號條帶序列較TRIM39完整序列小，說明突變體構(gòu)建成功。

2.3 禽病毒蛋白（ALV）滴度測定

細(xì)胞攻毒后7 d進(jìn)行禽白血病病毒滴度測定，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)、以3次平行測定的D540 nm均值為橫坐標(biāo)作圖，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2達(dá)到0.988 5（補(bǔ)充材料），禽病毒蛋白濃度曲線擬合曲線符合相關(guān)性檢驗（0

由圖4-A可知，pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞胞外禽白血病病毒濃度高于對照組但相差不大;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞禽白血病病毒濃度與pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞相差不明顯且高于pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞;雞胚成纖維細(xì)胞直接攻禽白血病病毒濃度較高，說明TRIM39具有一定的降低禽白血病病毒胞外分泌的作用。圖4-B可知，pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞胞內(nèi)禽白血病病毒濃度明顯高于對照組;pDsRed2-C1-TRIM39缺RING突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞禽白血病病毒濃度與pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞相差不明顯且明顯高于 pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞;雞胚成纖維細(xì)胞直接攻禽白血病病毒濃度較pDsRed2-C1-TRIM39完整序列轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞高，且低于pDsRed2-C1-TRIM39缺B30.2突變體轉(zhuǎn)雞胚成纖維細(xì)胞，說明TRIM39具有一定的降低胞內(nèi)禽白血病病毒的作用。

3 討論

本研究通過基因重組技術(shù)獲得了雞TRIM39基因的原核表達(dá)載體，為避免基因反向插入的問題，在設(shè)計引物時有意識地引入了BamH Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切位點，保證了目的片段正確插入原核表達(dá)載體并與載體擁有一致的開放閱讀框。研究選用E. coli Rosetta作為表達(dá)菌株，它是一個廣泛用于表達(dá)外源蛋白的菌株，外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)受溫度、誘導(dǎo)時間等的影響。首先，誘導(dǎo)溫度的高低會影響表達(dá)蛋白的溶解性，37 ℃誘導(dǎo)的上清液中可溶性蛋白含量明顯少于28 ℃誘導(dǎo)的，說明低溫條件有利于TRIM39的可溶性表達(dá)，因此本試驗中采用 28 ℃ 誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，以獲得具有活性的可溶性蛋白用于純化，但是誘導(dǎo)時間長短對蛋白表達(dá)量影響并不大。

另外，本研究中采用生物信息學(xué)分析手段設(shè)計引物并成功獲得了TRIM39基因的2個突變體，即TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2。根據(jù)報道，TRIM蛋白家族對逆轉(zhuǎn)錄病毒具有一定的抑制作用，因此本研究以禽白血病病毒為模型，研究了TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白對禽白血病病毒的抑制作用，發(fā)現(xiàn)三者均有抗病毒效應(yīng)，但是TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白的抑制效果明顯弱于TRIM39蛋白，說明RING結(jié)構(gòu)域及B-box結(jié)構(gòu)域可能對TRIM39的抗病毒效應(yīng)有一定的影響。另外，本試驗結(jié)果還表明，TRIM39、TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2蛋白還可能影響禽白血病病毒的細(xì)胞外釋放，而且TRIM39ΔRING、TRIM39ΔB30.2處理組細(xì)胞的病毒胞外釋放量高于TRIM39處理組，說明TRIM39的抑制作用可能通過抑制病毒的釋放實現(xiàn)，但RING結(jié)構(gòu)域及B-box結(jié)構(gòu)域在此過程中是否發(fā)揮作用還需進(jìn)一步驗證。

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