謝鏜寧，吳灝，王永剛，彭維，蘇薇薇，李沛波

(中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

柚皮苷屬于二氫黃酮類化合物，化學(xué)名為7-[[2-O-(6-脫氧-α-L-鼠李糖基) -β-D-吡喃葡萄糖基]氧代]-2,3-二氫-5-羥基-2-(4-羥基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮。柚皮素是柚皮苷水解掉一分子葡萄糖和鼠李糖得到的苷元，柚皮苷口服后，大部分是在腸道內(nèi)被腸道菌群脫糖基化代謝為柚皮素后經(jīng)腸壁被吸收入血[1-2]。柚皮苷廣泛存在于蕓香科植物葡萄柚、桔、橙等水果植物及化橘紅、骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼、橘紅、菝葜等中藥中；在日常食用較多的橙汁及葡萄柚汁中也普遍含有柚皮苷[3]。尤其在葡萄柚汁中，柚皮苷的含量可達(dá)0.5 mg·mL-1[4]。

枸櫞酸噴托維林是非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，1956年被合成后由比利時(shí)聯(lián)合化學(xué)公司(Ucb)開發(fā)，國內(nèi)于1962年開始生產(chǎn)。其鎮(zhèn)咳作用與可待因相當(dāng)，除對(duì)延髓的呼吸中樞有直接抑制作用外，還有輕度的阿托品樣作用。臨床適用于具有無痰干咳癥狀的疾病，急性支氣管炎，慢性支氣管炎及各種原因引起的咳嗽均可應(yīng)用[5-6]。柚皮苷廣泛存在于臨床上用于治療咳嗽、咯痰的中藥材或中成藥中[7-10]，與枸櫞酸噴托維林聯(lián)合使用的可能性很大。因此，有必要對(duì)柚皮苷和柚皮素與枸櫞酸噴托維林是否會(huì)發(fā)生相互作用進(jìn)行研究，以提高用藥的安全性。

細(xì)胞色素P450 (CYP450)酶是肝臟和腸中最為重要的Ⅰ相代謝酶，可催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)的(包括大多數(shù)臨床藥物)代謝；CYP450酶具有可誘導(dǎo)性和可抑制性。因此，藥物對(duì)CYP450酶活性的抑制或誘導(dǎo)是引發(fā)藥物相互作用的常見機(jī)制。目前，關(guān)于柚皮苷和柚皮素是否會(huì)通過影響CYP450酶活性來影響枸櫞酸噴托維林的代謝，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用體外溫孵法評(píng)估柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響，為臨床安全合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 柚皮苷(由本團(tuán)隊(duì)委托廣東環(huán)球制藥有限公司生產(chǎn)，純度>99%)；柚皮素(Sigma公司，純度>98%，批號(hào)：083K1328)；枸櫞酸噴托維林(中國生物制品檢定所，含量測(cè)定，批號(hào)：100432-200401)；曲安奈德(中國生物制品檢定所，含量測(cè)定，批號(hào)：100055-200302)；還原型輔酶Ⅱ四鈉(NADPH，廣州威佳生物科技有限公司，批號(hào)：2009/08)。

1.2 設(shè)備與儀器 DIONEX P680高效液相色譜儀(UVD 170U 紫外檢測(cè)器、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器)，Chromeleon Client Programm色譜處理軟件(Dionex，美國)；TU-19101雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用公司)；高速離心機(jī)(3K-18，Sigma公司)；系列精密移液器(美國Rainin公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠，7周齡，雄性，體重200～220 g，SPF 級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK(粵)2004-0020，人工光循環(huán)12 h/12 h，溫度為(24±2.0)℃，濕度為55%±5%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)流程遵循中山大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 溶液的配制 柚皮苷和柚皮素標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取105 ℃干燥至恒重的柚皮苷對(duì)照品5.83 mg和柚皮素對(duì)照品2.86 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加250 μL二甲基亞砜(DMSO)溶解，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶液定容，配制成濃度為1 mmol·L-1的母液，再分別精密吸取母液適量，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶液稀釋成濃度為100、10 μmol·L-1的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，備用。噴托維林標(biāo)準(zhǔn)貯備液：精密稱取真空干燥至恒重的噴托維林對(duì)照品5.26 mg，置于10 mL容量瓶中，用0.1 mol·L-1Tris-KCl溶解并定容，配制成濃度為1 mmol·L-1的母液，備用。曲安奈德內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取真空干燥至恒重的曲安奈德對(duì)照品7.14 mg，置于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.714 mg·mL-1的溶液，備用。

2.2 大鼠肝微粒體的制備 取SD大鼠，禁食24 h，頸椎脫臼處死，迅速打開腹腔取出肝臟，用0～4 ℃生理鹽水清洗至呈土黃色，吸干后稱肝質(zhì)量；取約1 g肝臟，加入3 mL勻漿液，于4 ℃條件下勻漿，勻漿液傾入預(yù)冷的離心管中，于10 500×g條件下離心30 min；取上清液與88 mmol·L-1CaCl2溶液混勻，使CaCl2終濃度為8.8 mmol·L-1，冰浴5 min后，于4 ℃和22 000 g條件下離心30 min；沉淀用重懸液重懸，采用BCA-100試劑盒測(cè)定肝微粒體蛋白含量，用Omura法測(cè)定CYP450酶的含量。

2.3 體外孵育條件確定 取制備好的大鼠肝微粒體，用重懸液稀釋成1.0 mg·mL-1蛋白濃度的混懸液，取此混懸液150 μL，加入一定量的藥物(底物)溶液混勻，于37 ℃預(yù)孵育5 min。用含NADPH的1%NaHCO3溶液20 μL(終濃度1 mmol·L-1)啟動(dòng)反應(yīng)，終體積為250 μL，于37 ℃下孵育一定時(shí)間后，置冰浴中終止反應(yīng)，置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。

2.4 枸櫞酸噴托維林測(cè)定方法學(xué)考察

2.4.1 色譜條件 色譜柱為大連依利特BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05 mmol·L-1庚烷磺酸鈉(含0.3%三乙胺，pH 3.0)(45∶55)，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長為210 nm。

2.4.2 樣品處理 在樣品中加入10 μL濃度為0.714 mg·mL-1的曲安奈德溶液后，加入200 μL甲醇,渦旋混合2 min后，離心10 min (12 000 rpm，4 ℃)，精密吸取20 μL進(jìn)樣。

2.4.3 選擇性研究 分別配制3種溶液各150 μL，其中，一份為失活后的肝微粒體，作為空白體系，一份為失活后的肝微粒體加入枸櫞酸噴托維林及內(nèi)標(biāo)曲安奈德，一份為肝微粒體加入枸櫞酸噴托維林，分別孵育后，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，考察大鼠肝微粒體中的雜質(zhì)對(duì)藥物的檢測(cè)是否存在干擾。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取枸櫞酸噴托維林標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，加入滅活肝微粒體配制成濃度為5、25、50、75、100及125 μmol·L-1的150 μL標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，以待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.5 準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn) 取肝微粒體和Tris-KCl溶液置于離心管中，分別加入枸櫞酸噴托維林標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成濃度為10、50和100 μmol·L-1的質(zhì)控樣品溶液，平行6份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取肝微粒體和Tris-KCl置于離心管中，分別加入枸櫞酸噴托維林標(biāo)準(zhǔn)貯備液，配成濃度為10、50及100 μmol·L-1的溶液，平行6份，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。另配制枸櫞酸噴托維林標(biāo)準(zhǔn)品溶液，通過二者的比值計(jì)算回收率。

2.5 代謝時(shí)間曲線研究 分別制備10、50及120 μmol·L-13個(gè)濃度的枸櫞酸噴托維林溶液，按上述孵育方法孵育15、30、45、60及90 min后，按“2.4.2”項(xiàng)下方法處理后用高效液相色譜(HPLC)法測(cè)定剩余枸櫞酸噴托維林的量，然后作出枸櫞酸噴托維林的代謝時(shí)間-濃度曲線，以確定最佳孵育時(shí)間。

2.6 枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝動(dòng)力學(xué)研究 分別制備濃度為10、20、40、60、80、100和120 μmol·L-1的枸櫞酸噴托維林溶液，在肝微粒中孵育60 min后，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，用HPLC測(cè)定剩余底物的量。根據(jù)Lineweaver-Burk方程式：1/V=Km/(Vmax×[S])+1/Vmax，以底物濃度的倒數(shù)1/[S]對(duì)反應(yīng)速度的倒數(shù)1/V進(jìn)行線性回歸，截距的倒數(shù)即為最大反應(yīng)速度(Vmax)，斜率乘以Vmax即為米氏常數(shù)(Km)。

2.7 柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響 采用一系列濃度的柚皮苷和柚皮素溶液(180、90、30、10、3.3、1.1、0.33及0.11 μmol·L-1)與枸櫞酸噴托維林溶液進(jìn)行共孵育60 min后，按“2.4.2”項(xiàng)下操作，用HPLC測(cè)定剩余枸櫞酸噴托維林的量。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，研究不同濃度的柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林代謝的影響。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 枸櫞酸噴托維林測(cè)定方法學(xué)結(jié)果

3.1.1 選擇性 如圖1所示，在選定的色譜條件下，枸櫞酸噴托維林的保留時(shí)間為7.0 min左右，空白體系在枸櫞酸噴托維林及內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間無雜質(zhì)峰干擾，提示本HPLC檢測(cè)方法具有良好的選擇性。

A.空白孵育體系圖譜；B.空白孵育體系加入枸櫞酸噴托維林和內(nèi)標(biāo)的圖譜；C.肝微粒體體系中加入枸櫞酸噴托維林和內(nèi)標(biāo)孵育后的圖譜 1.枸櫞酸噴托維林；2.內(nèi)標(biāo)

3.1.2 準(zhǔn)確度、精密度和回收率試驗(yàn) 如表1所示，采用本條件下的HPLC法測(cè)定枸櫞酸噴托維林樣品，準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)的偏差值均小于±15%，回收率均在90.0%～110.0%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析方法的要求。說明該測(cè)定方法準(zhǔn)確度、精密度、回收率良好，符合生物樣品檢測(cè)要求，適用于枸櫞酸噴托維林的檢測(cè)。

表1 準(zhǔn)確度、精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 結(jié)果顯示，在5～125 μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.031 5X-0.019 5,R2=0.999 8。說明在該線性范圍內(nèi)，枸櫞酸噴托維林的濃度與色譜峰面積之間線性關(guān)系良好。

3.2 枸櫞酸噴托維林代謝時(shí)間-濃度曲線研究 如表2所示，在方法學(xué)開發(fā)試驗(yàn)中，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到60 min，枸櫞酸噴托維林的代謝已基本達(dá)到平臺(tái)期，符合試驗(yàn)要求。因此，在方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)及樣品測(cè)定試驗(yàn)中，選擇60 min作為孵育體系的代謝時(shí)間。

表2 枸櫞酸噴托維林代謝時(shí)間-濃度變化結(jié)果(n=3)

3.3 枸櫞酸噴托維林酶動(dòng)力學(xué)研究 根據(jù)Lineweaver-Burk方程式得到的曲線方程為Y=16 685X+575.21(X為底物濃度的倒數(shù)，Y為反應(yīng)速度的倒數(shù)，R2=0.991)，求得Vmax為1.74 nmol·(min·mg)-1，Km為29.00 μmol·L-1。因此，確定30 μmol·L-1作為枸櫞酸噴托維林的代謝反應(yīng)的底物濃度。

3.4 柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響 柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響結(jié)果見表3。以空白對(duì)照組代謝量為100%，計(jì)算柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的相對(duì)抑制率。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，柚皮苷和柚皮素各劑量組的代謝量與空白對(duì)照組的代謝量無顯著性差異(P>0.05)。說明柚皮苷和柚皮素濃度在(0.11～180) μmol·L-1范圍內(nèi)對(duì)枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝無明顯影響。

表3 柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中代謝的影響(n=3)

4 討論

柚皮苷及其苷元柚皮素廣泛存在于多種植物或中藥中，近年來，越來越多的研究報(bào)道其各種藥理活性，如，抗糖尿病、免疫調(diào)節(jié)、抗骨質(zhì)疏松、抗氧化、抗炎、改善神經(jīng)功能障礙、改善糖脂代謝紊亂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗癌等藥理作用[11-15]。在我國，隨著中西醫(yī)結(jié)合的深入發(fā)展，中西藥物并用的用藥方式日趨普遍。因此，研究柚皮苷及其苷元柚皮素與臨床常用藥物之間的相互作用是十分必要的。

枸櫞酸噴托維林是非成癮性中樞鎮(zhèn)咳藥，臨床用于具有無痰干咳癥狀的疾病，急性支氣管炎、慢性支氣管炎及各種原因引起的咳嗽可應(yīng)用[5]。枸櫞酸噴托維林也是多種復(fù)方止咳祛痰藥的主要成分[16-18]。雖然枸櫞酸噴托維林在臨床應(yīng)用時(shí)間已超過60年，但是，關(guān)于其藥代動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道依然很少。目前，未見文獻(xiàn)報(bào)道枸櫞酸噴托維林是被何種肝藥酶亞型所代謝。

本實(shí)驗(yàn)采用體外溫孵法評(píng)估柚皮苷和柚皮素對(duì)枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝的影響，研究結(jié)果表明，在濃度為(0.11～180) μmol·L-1的濃度范圍內(nèi)，柚皮苷和柚皮素均未對(duì)枸櫞酸噴托維林經(jīng)大鼠肝微粒體代謝產(chǎn)生顯著影響，提示柚皮苷和柚皮素不影響枸櫞酸噴托維林在大鼠肝微粒體中的代謝。