趙愛娟 丁義峰 劉 萍

（河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453007）

1 豬博卡病毒的發(fā)現(xiàn)

2005年，Allander 等［1］借助分子篩的方法從兒童呼吸道感染的樣品中發(fā)現(xiàn)了一種新的微小病毒，該病毒可以感染人類，故稱之為人博卡病毒（Human Bocavirus，HBoV）。2009年，Blomstrom 等通過隨機(jī)多重置換方法（random multiple displacement amplification，MDA）在瑞典豬（患多系統(tǒng)衰竭綜合征）樣品中分離出一段病毒基因組序列，該序列長為1879bp。通過序列分析并與已知病毒基因組序列相比較，發(fā)現(xiàn)該序列有完整的NP1氨基酸序列，且與牛細(xì)小病毒（Bovine parvovirus，BPV）同源性最高，同時與HBoV、犬微小病毒（Canine minute virus，CnMV）和BPV 處于同一進(jìn)化簇，但與豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus ，PPV）無親緣關(guān)系。由于對該微小病毒研究尚不徹底，沒有完整的基因組序列，故當(dāng)時將其暫命名為豬博卡病毒（Porcine Boca-like virus，PBoV-like）［2］。2011年，國內(nèi)很多豬場的豬連續(xù)出現(xiàn)腹瀉性疾病，研究人員從腹瀉仔豬的糞便中分離出了豬博卡病毒［3］。

2 豬博卡病毒的生物學(xué)性狀

豬博卡病毒為博卡病毒屬，微小病毒科，細(xì)小病毒亞科。豬博卡病毒體積小，無囊膜，呈正二十面體。其基因組為單鏈線性DNA，為DNA 病毒。研究人員對其DNA 測序發(fā)現(xiàn)，DNA 鏈短且結(jié)構(gòu)簡單，僅有5.2kb［4］。豬博卡病毒與其他細(xì)小病毒科的成員不同，除具有與其他成員相同的2個開放閱讀框ORF1和ORF2外，還有一個開放閱讀框ORF3。病毒的DNA 能轉(zhuǎn)錄翻譯4種蛋白質(zhì)，分別為NS1、VP1、VP2和NP1（圖1）。其中VP1、VP2為結(jié)構(gòu)蛋白，是主要的抗原蛋白，NS1、NP1為非結(jié)構(gòu)蛋白［5］。研究發(fā)現(xiàn)，博卡病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白較為保守，而結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2較易發(fā)生突變，不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的基因突變可能會導(dǎo)致新種群的產(chǎn)生，也有可能是病毒逃逸機(jī)體免疫系統(tǒng)監(jiān)視的重要機(jī)制，穩(wěn)定的NS1基因可能成為制備疫苗和藥物作用的靶位點(diǎn)［6］。譚紹敏分析了28條豬博卡病毒的基因組序列，發(fā)現(xiàn)豬博卡病毒普遍存在基因插入現(xiàn)象，而且變異率較高，具有遺傳多樣性［7］。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)在病毒的ORF1中，有與病毒滾環(huán)復(fù)制、解螺旋酶 （Helicase） 和三磷酸腺苷酶（ATPase） 活性相關(guān)的保守序列。在病毒的ORF2中，VP1基因編碼序列內(nèi)有與病毒感染性相關(guān)的磷脂酸A2序列存在，且與鈣離子結(jié)合環(huán)及催化殘基相關(guān)序列連在一起［8］。而ORF3（編碼NP1蛋白）功能尚不明確，但有報道顯示與豬博卡病毒同屬的犬極細(xì)小病毒或犬博卡病毒的ORF3與病毒的復(fù)制密切相關(guān)［9］。

圖1 PBoV 的基因結(jié)構(gòu)模式

3 豬博卡病毒的致病機(jī)制

Abdel 等［10］研究發(fā)現(xiàn)豬博卡病毒侵染靶細(xì)胞后，靶細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物釋放到外環(huán)境中，呈壞死性變化，而不是發(fā)生細(xì)胞凋亡。現(xiàn)已普遍認(rèn)為結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用，是細(xì)小病毒的多功能磷酸化蛋白。李建寧等［11］用敲除NS1基因的載體感染靶細(xì)胞，病毒基因組喪失感染力和致病性。而敲除NP1基因后，病毒的DNA 復(fù)制能力也大幅度下降。用病毒的NS1、VP1、VP2、NP1基因分別侵染靶細(xì)胞，靶細(xì)胞沒有明顯的病變特征。武剛利用豬博卡病毒細(xì)胞培養(yǎng)物感染3日齡的仔豬，發(fā)現(xiàn)被感染仔豬出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象。對仔豬進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)被感染仔豬腹股溝淋巴結(jié)和結(jié)腸腫大，腸道、肺臟、腹股淋巴結(jié)均有不同程度的出血，最終檢測到被感染豬的腸道內(nèi)有豬博卡病毒［12］。Zhang 等利用人博卡病毒（HBoV）克隆載體感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HBoV 能明顯抑制IFN-β 的產(chǎn)生，IFN-β 是由仙臺病毒和多聚脫氧腺－胸苷酸［poly（deoxyadenylic-thymidylic）acid］誘導(dǎo)產(chǎn)生的，同時證實病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NP1在該過程中發(fā)揮了重要作用［13］。

4 豬博卡病毒的國內(nèi)流行情況

2009年，Zhai 等［14］首次證明了我國豬群中存在豬博卡病毒感染，在患呼吸道疾病的斷奶仔豬中的感染率（69.7%，69/99）明顯高于在其他豬群中的感染率（0～13.6%）。對來自浙江、江西、安徽、河北、河南、江蘇、北京、上海、新疆9省市的送檢病料，PBoV 的檢出率在12.5%～88.9%，并且在健康的豬樣品中也檢測到PBoV 的存在，檢出率為7.3%（3/41）。2010年，Shan 等［15］從340份豬病料中檢測到PBoV，這340份豬病料分別來自上海、安徽、江蘇、山東及貴州，其陽性率高達(dá)45%～75%。2010年Cheng 等［16］檢測397份病料，檢測出PBoV 陽性率為12.9%。2011年，中國香港學(xué)者Lau SK 等［8］從香港生豬屠宰場和養(yǎng)豬場的健康豬和病死豬中采集333份健康豬和病死豬的淋巴結(jié)、血清和糞便等樣品，通過PCR 方法檢出55份PBoV 陽性樣品，陽性率為16.5%。胡軍勇等［17］對河南、湖北、湖南的各大豬場進(jìn)行了調(diào)查研究，從79個規(guī)?；i場采集了248份病料樣品，這些樣品中有172份為PBoV 陽性，陽性率高達(dá)69.35%。這些研究結(jié)果表明，豬博卡病毒在我國豬群中廣泛存在，可能會導(dǎo)致一些呼吸道疾病的發(fā)生。

5 豬博卡病毒的檢測方法

目前，對豬博卡病的檢測方法主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、熒光定量PCR 法、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)、間接免疫熒光技術(shù)。

1）PCR：翟少倫等［18］參照GenBank 發(fā)表的豬博卡病毒的唯一序列，利用引物設(shè)計軟件Primer 5.0，設(shè)計一對在編碼VP1/VP2蛋白的基因區(qū)特異性的引物。擴(kuò)增大小為496bp 目的基因。在國內(nèi)首次建立了豬博卡病毒的檢測方法，其優(yōu)點(diǎn)是：特異性強(qiáng)，重復(fù)性較好，敏感性高。

2）熒光定量PCR 檢測方法：鄧波等［19］根據(jù)GenBank 公布的豬博卡病毒序列，在VPl/2基因區(qū)域設(shè)計引物和TaqMan 探針建立實時熒光定量PCR 檢測方法，利用該方法對上海市10個區(qū)規(guī)模場2006—2011年間采集的1800份豬血清、2010年種豬場不同月份采集的45份豬糞便、2010年9個規(guī)模場采集的27份豬鼻棉拭，以及門診采集的9份高熱病死豬內(nèi)臟進(jìn)行檢測，陽性率依次為24%、30%、0%、67%。

3）環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）技術(shù)：李彬等［20］建立了PBoV 的LAMP（loop-mediated isothermal amplification）檢測方法。該技術(shù)分別使用特異對應(yīng)于靶序列中8個基因區(qū)段的3對特異性引物，并在Bst DNA 聚合酶的作用下對靶序列進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)，整個反應(yīng)只需在65℃的恒溫水浴中1～2h。該方法的步驟為，設(shè)計LAMP 引物，優(yōu)化LAMP 反應(yīng)體系，LAMP 檢測程序。研究人員根據(jù)檢測的原理和方法設(shè)計一套檢測試劑盒，該試劑盒雖不需要先進(jìn)的設(shè)備，但具有特異性強(qiáng)，敏感性高，操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，因此易于推廣使用。

4）間接免疫熒光技術(shù)：Mckillen 等［21］建立了PBoV 原代細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的同時，構(gòu)建了間接免疫熒光方法，主要的操作為：首先將待測細(xì)胞用未標(biāo)記的抗體處理，使之與特異性的抗原形成復(fù)合物，然后再用熒光標(biāo)記使抗體著色，可檢測出特異抗原在細(xì)胞中的存在部位，并且有熒光增強(qiáng)效應(yīng)。Mckillen 等在豬原代腎細(xì)胞的細(xì)胞核發(fā)現(xiàn)了綠色熒光集結(jié)，細(xì)胞質(zhì)周圍顏色較暗。

6 疾病的癥狀及豬博卡病毒的防控方法

1）疾病的癥狀：豬博卡病毒可感染動物的呼吸道及腸道，使動物出現(xiàn)支氣管炎、肺炎和急性與慢性腸炎等癥狀，甚至?xí)l(fā)動物流產(chǎn)、死胎及死亡。感染博卡病毒的產(chǎn)房哺乳仔豬多在出生2～3日后，出現(xiàn)嚴(yán)重的腹瀉，糞便呈黃綠色、淡黃綠色或灰白色，部分仔豬有嘔吐癥狀，致使仔豬消瘦，精神沉郁，被毛粗亂，少吃或不吃，一般在5～7日內(nèi)死亡，10日齡內(nèi)的乳豬死亡率高達(dá)80%，隨日齡的增加，死亡率逐漸降低。

2）防控方法：做好消毒工作，使用碘制劑類和燒堿加強(qiáng)消毒，對喂養(yǎng)的飼料進(jìn)行消毒處理。母豬產(chǎn)床前后消毒，產(chǎn)仔舍消毒，飼養(yǎng)員消毒；提高豬群營養(yǎng)補(bǔ)充，增強(qiáng)豬的免疫力，注重其他疾病的防控，例如定期接種豬呼吸與繁殖障礙綜合征疫苗、豬瘟疫苗、豬圓環(huán)疫苗和偽狂犬疫苗等疾病疫苗，以防止出現(xiàn)混合感染加重病情； 加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，及時隔離患病豬群，合理處理死亡豬群，堅持不從疫病區(qū)引種，確保飼喂的飼料沒有發(fā)霉變質(zhì)，以增強(qiáng)豬的非特異性免疫；做好干燥通風(fēng)工作，在豬舍欄桿及潮濕處灑生石灰，進(jìn)行干燥消毒，豬需定期通風(fēng)；母豬反飼，對母豬進(jìn)行反飼，以預(yù)防疾病發(fā)生，用仔豬糞便對產(chǎn)前6周母豬進(jìn)行返飼，方法是采集病豬的腸內(nèi)容物或仔豬的糞便研磨稀釋處理后加入飼料中，飼養(yǎng)母豬。

7 小結(jié)

豬博卡病毒是研究人員在豬群中新發(fā)現(xiàn)的病原體。隨著研究的深入，在豬博卡病毒的流行病學(xué)及病原學(xué)方面取得了一定的進(jìn)展。但是，目前該病毒的臨床致病機(jī)制及是否與其他病原體協(xié)同致病尚不清楚，仍需進(jìn)一步研究。由于人類和豬關(guān)系密切，豬博卡病毒的基因和人博卡病毒的基因可能會發(fā)生重組，甚至可能感染人類。因此，對豬博卡病毒的深入研究在公共衛(wèi)生學(xué)方面具有重要意義。