李兆鵬，姜楠南，孫 音，王 媛，房義福，徐金光*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園林與林學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南255014）

芍藥（Paeonia lactiflora）系芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia），是我國(guó)著名的觀賞花卉，為傳統(tǒng)名花之一，在我國(guó)栽種歷史可追溯至4000年前。芍藥與享有“花王”的牡丹（Paeonia suffruticosa）齊名，有“花相”之稱[1]，深受百姓喜愛。但目前大多為露地栽培，芍藥主產(chǎn)區(qū)自然花期多集中在5月中上旬，為了使芍藥在其自然花期之前進(jìn)入市場(chǎng)供花，提升利潤(rùn)空間，讓芍藥真正走向市場(chǎng)，進(jìn)行促成栽培是解決這一問題的主要方式之一。但盆栽芍藥在催花過程中，經(jīng)常會(huì)因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)不足出現(xiàn)生長(zhǎng)不良、敗育率高、開花差的現(xiàn)象。因此，保證芍藥在生長(zhǎng)開花時(shí)營(yíng)養(yǎng)充足是解決上述問題的有效途徑。

氮素有植物的“生命元素”之稱，是植物生命活動(dòng)中所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一[2]。氮素通過影響氮素代謝，生物量的分配以及光合作用等來最終調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品質(zhì)。因此，研究氮素水平對(duì)芍藥的生長(zhǎng)及成花品質(zhì)影響有著重要意義。

本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)置4個(gè)不同氮水平，了解促成栽培盆栽芍藥氮代謝的生理特性，提高氮肥利用率，旨在為為芍藥實(shí)踐生產(chǎn)中科學(xué)合理施用氮素提供可量化指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試品種為‘大富貴’，種苗來自濟(jì)南市唐王苗圃試驗(yàn)田，為4年生分株苗，每株約含8～10個(gè)飽滿健壯的花芽，植株根系完整、健壯、無病蟲害、無機(jī)械損傷，在濟(jì)南市歷城區(qū)國(guó)際鮮花港的溫室中進(jìn)行促成栽培實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)采用單因子四水平隨機(jī)試驗(yàn)，氮肥施用量設(shè)四個(gè)水平，氮源為尿素，以液肥形式施用，施用濃度分別為 0、150、300、450mg/L，每個(gè)處理 25 株芍藥，共100株。實(shí)驗(yàn)處理從2018年12月10日（萌芽期）施營(yíng)養(yǎng)液(改良霍格蘭)，每20天 1次，共 3次，每株1L。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定及方法

1.2.2.1 盆栽芍藥生長(zhǎng)開花標(biāo)的測(cè)定

株高：測(cè)量盛花期從花枝基部到花朵頂部的距離

地莖：用游標(biāo)卡尺量取盛花期時(shí)花枝基部的直徑

冠幅：盛花期時(shí)，分別從兩個(gè)方向測(cè)量芍藥冠幅，取平均值

花徑：花朵完全展開時(shí)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量其直徑

著花量：每個(gè)處理統(tǒng)計(jì)10盆芍藥所有的開花量

1.2.2.2 盆栽芍藥氮代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定

選擇芍藥葉片光合功能旺盛的展葉期、顯蕾期、透色期、盛花期。每個(gè)處理選5株生長(zhǎng)健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的芍藥，每株隨機(jī)采3片葉片。采樣后立即放入液氮中，然后帶回實(shí)驗(yàn)室放入-80℃冰箱備用。硝酸還原酶（NR）活性參照趙世杰[3]的方法；谷氨酰合成酶（GS）活性采用Lea[4]的方法進(jìn)行測(cè)定；谷氨酸合成酶（GOGAT）活性采用鄭朝峰[5]的方法測(cè)定；谷氨酸脫氫酶（GDH）活性采用Cren and Hirel[6]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 Microsoft Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果分析

2.1 不同氮素水平對(duì)“大富貴”生長(zhǎng)及開花的影響

研究發(fā)現(xiàn)，隨著供氮水平的增加，株高、地莖以及冠幅都出現(xiàn)一直增大的趨勢(shì)，且施肥處理相較對(duì)照都出現(xiàn)顯著性差異。如表1，在株高上，N450處理達(dá)到45cm，相比其他施肥處理分別增大了12.5%、4.6%。在地莖上，N450處理達(dá)到0.88cm，相比其他施肥處理分別增加了4.8%、1.2%。在冠幅上，N450處理達(dá)到了39cm，相比其他施肥處理分別提高了8.3%、2.6%。但花徑和開花數(shù)量卻隨供氮水平增加，出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，且N450處理和對(duì)照并無顯著性差異。這說明過量施氮不利于芍藥的開花。

表1 供氮水平對(duì)芍藥生長(zhǎng)開花的影響

2.2 供氮水平對(duì)盆栽芍藥不同生育期葉片硝酸還原酶活性的影響

從圖1中可以看出，在所有生育期，施氮處理相較對(duì)照，均對(duì)Nr活性有顯著性提高。這說明氮素對(duì)Nr活性有明顯的促進(jìn)作用。在顯蕾期、透色期和盛花期，各處理間葉片Nr活性有顯著性差異，施氮水平與Nr活性成正相關(guān)。而在展葉期，不同處理的Nr活性均較低，施肥處理之間差異并不顯著。這說明芍藥在展葉期的葉片的Nr活性的還原能力較低，由氮素水平引起的Nr活性差異并不顯著。從整個(gè)生育期來看，Nr活性隨著生育期的推進(jìn)變化趨勢(shì)基本一致，均呈現(xiàn)先增大后持續(xù)減小單峰變化，但施肥處理不同，峰值出現(xiàn)的生育期也不同。N0、N150以及N300處理峰值均出現(xiàn)在顯蕾期，此時(shí)期N150以及N300處理相比對(duì)照分別提高了8.2%、19.7%。N450處理峰值出現(xiàn)在透色期，相比同期其他處理分別提高了57.6%、46.4%、30.1%。因此除了供氮水平，生育期也影響著Nr活性的變化。

圖1 不同氮素水平對(duì)芍藥葉片硝酸還原酶活性的影響

2.3 供氮水平對(duì)盆栽芍藥不同生育期葉片谷氨酸合成酶活性的影響

圖2 不同氮素水平對(duì)芍藥葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在展葉期和顯蕾期，GS活性隨氮素水平增大而增大，且施肥處理的GS活性顯著大于對(duì)照處理，分別增大了15.4%-25.6%和9.1%-20.5%。在透色期，GS活性與在一定供氮水平下（0-300mg/L）呈顯著正相關(guān)，而N450處理相較同期施肥處理分別下降了7.3%、12.2%。在盛花期，GS活性仍在0-300mg/L氮水平下呈正相關(guān)，但N300和N150處理并沒有顯著性差異，且N450處理仍舊在下降。從整個(gè)生育期來看，不同處理均隨著芍藥的生長(zhǎng)發(fā)育呈單峰趨勢(shì)，在顯蕾期達(dá)到峰值，之后慢慢下降?？傮w來看芍藥葉片GS活性受氮素水平調(diào)控，但不同生育期的表現(xiàn)不同，這說明生育期影響著GS活性。

2.4 供氮水平對(duì)盆栽芍藥不同生育期葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響

從圖3中可以看出，GOGAT活性隨著生育期的推進(jìn)，各處理呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在顯蕾期，與GS活性變化趨勢(shì)一致。在不同的生育期，供氮水平的不同也對(duì)GOGAT活性有著不同影響。在展葉期和顯蕾期，GOGAT活性隨氮素水平增大而增大，且施肥處理的GS活性顯著大于對(duì)照處理。在透色期和盛花期，N450處理的GOGAT活性明顯下降，且相較同期施肥處理分別下降了6.1%、20.1%和6.3%、9.5%，這說明在這兩個(gè)時(shí)期高氮對(duì)GOGAT活性有所抑制。

圖3 不同氮素水平對(duì)芍藥葉片谷氨酸合成酶活性的影響

2.5 供氮水平對(duì)盆栽芍藥不同生育期葉片谷氨酸脫氫酶活性的影響

從圖4上看，在各個(gè)生育期，GDH活性均與供氮水平成正相關(guān)。在展葉期，各處理之間差異并不大，施肥處理相較對(duì)照僅僅分別提高2.3%、4.9%、7.3%。在顯蕾期和透色期，各處理之間出現(xiàn)顯著性差異，相較對(duì)照，施肥處理GDH活性分別在同期提升了4.9%、11.5%、16.2%和5%、9.4%、16.07%。在盛花期雖然施肥處理仍與對(duì)照存在顯著性差異，但N150和N300處理之間差異并不大。從整個(gè)生育期來看，各處理均出現(xiàn)一直增大的趨勢(shì)。這說明，生育期也影響著GDH活性變化。

圖4 不同氮素水平對(duì)芍藥葉片谷氨酸脫氫酶活性的影響

2.6 不同施氮水平和生育期對(duì)盆栽芍藥關(guān)鍵酶代謝活性的雙因素方差分析

從表2可以看出施氮水平、生育期以及施氮水平和生育期的交互作用均對(duì)氮代謝關(guān)鍵酶活性有著極顯著的影響。Nr以氮水平對(duì)其活性影響最大，GOGAT、GS、GDH則是以生育期對(duì)其影響最大，供氮水平次之。

表2 不同施氮水平和生育期對(duì)盆栽芍藥關(guān)鍵酶代謝活性的雙因素方差分析

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，隨著供氮水平的增加，株高、地莖以及冠幅都出現(xiàn)一直增大的趨勢(shì)，且施肥處理相較對(duì)照都出現(xiàn)顯著性差異。這說明氮素對(duì)芍藥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。但花徑和開花數(shù)量卻隨供氮水平增加，出現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，且N450處理和對(duì)照并無顯著性差異。這可能是因?yàn)榈厥且环N信號(hào)物質(zhì)，和細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素等植物激素存在互作關(guān)系[7]，過量施用氮肥加大了對(duì)內(nèi)源激素的刺激，導(dǎo)致了芍藥生長(zhǎng)過快，加劇了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)對(duì)養(yǎng)分的競(jìng)爭(zhēng)，從而推遲生殖生長(zhǎng)，導(dǎo)致開花質(zhì)量下降。有研究表明，氮肥通過提高葉片氮素含量和SPAD值來提高開花數(shù)量[8-9]。

硝酸還原酶是植物有機(jī)氮同化的中的第一個(gè)酶，也是限速酶。硝酸還原酶活性的大小影響著植物體內(nèi)硝態(tài)氮水平和蛋白質(zhì)合成速率[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，施氮顯著提高了Nr活性，且在不同生育期施氮水平與Nr活性成顯著正相關(guān)。這與劉娜[11]在甜菜上的研究結(jié)果一致。從整個(gè)生育期來看，Nr活性隨著生育期的推進(jìn)變化趨勢(shì)基本一致，均呈現(xiàn)先增大后持續(xù)減小單峰變化，但施肥處理不同，峰值出現(xiàn)的生育期也不同。有研究指出，施氮水平的不同可能會(huì)導(dǎo)致Nr活性出現(xiàn)的峰值的生育期不同[12]。在本實(shí)驗(yàn)中，N0、N150以及N300處理峰值均出現(xiàn)在顯蕾期，然后持續(xù)下降。這說明，芍藥吸氮高峰期出現(xiàn)在顯蕾期，氮代謝最旺盛，產(chǎn)生更多的蛋白質(zhì)，為芍藥生長(zhǎng)發(fā)育及構(gòu)建生殖器官形態(tài)做好物質(zhì)基礎(chǔ)。N450處理Nr活性峰值出現(xiàn)在透色期，這可能是過量氮素提高了Nr活性，導(dǎo)致Nr在還原硝態(tài)氮時(shí)需要消耗過多來自光合磷酸化產(chǎn)生的電子，減少流向固定CO2過程中的電子，從而抑制光合碳代謝，造成葉片貪青，碳水化合物積累過少，從而影響開花質(zhì)量，而在本實(shí)驗(yàn)中確實(shí)出現(xiàn)類似結(jié)果。

谷氨酰胺合成酶是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶，在多種氮代謝中起著重要作用[13]。谷氨酸合成酶在催化谷氨酰胺合成谷氨酸中起主要作用。GS和GOGAT在植物體內(nèi)組成的GS/GOGAT循環(huán)催化95%以上植物體內(nèi)無機(jī)氨[14]，起著重要的協(xié)同作用。在本實(shí)驗(yàn)中，GS和GOGAT兩種酶活性無論從供氮水平還是從生育期來看，變化趨勢(shì)基本一致。出現(xiàn)這種趨勢(shì)的原因可能是，反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)兩種酶活性產(chǎn)生了正反饋調(diào)節(jié)，是GOGAT活性對(duì)GS活性的一種適應(yīng)和自身調(diào)整。在展葉期和顯蕾期，兩種酶活性均隨氮素水平增大而增大，且施肥處理的酶活性顯著大于對(duì)照處理，可能是由硝酸還原酶（Nr）的還原產(chǎn)物NH4+對(duì)GS起到了促進(jìn)作用，提高了其活性，且在這兩個(gè)時(shí)期，Nr活性也表現(xiàn)出一致的曲線。在透色期，兩種酶活性在N450處理相較顯蕾期下降劇烈，可能是此時(shí)N450處理的Nr活性最高，產(chǎn)生大量的NH4+以及GS合成過多的谷氨酰胺，從而對(duì)GS活性產(chǎn)生了抑制。從整個(gè)生育期來看，兩種酶活性均在顯蕾期達(dá)到最高值，這可能是此時(shí)芍藥生長(zhǎng)最旺盛，需要大量的蛋白質(zhì)來構(gòu)建光合器官和生殖器官，因此此時(shí)GS/GOGAT活性提高有利于芍藥體內(nèi)氨同化的順利進(jìn)行。

谷氨酸脫氫酶（GDH）主要有兩個(gè)作用：一是當(dāng)植物體內(nèi)NH4+濃度過高時(shí)，它催化NH4+與α-酮戊二酸生成谷氨酸[15]；二是當(dāng)碳骨架受限制時(shí)，催化谷氨酸脫氫生成α-酮戊二酸為三羧酸循環(huán)提供碳骨架[16]。本實(shí)驗(yàn)中，在各個(gè)生育期，GDH活性均與供氮水平成正相關(guān)，說明施氮可以提高GDH活性。在不同生育期，GDH活性大小不同。在展葉期，各處理之間差異并不大，可能是因?yàn)镚DH有很高的Km值，對(duì)氨的親和力不高。在顯蕾期和透色期，各處理之間達(dá)到顯著差異?？赡苁窃陲@蕾期GS、GOGAT兩種酶活性最高，產(chǎn)生了大量谷氨酸，而谷氨酸作為GDH的誘導(dǎo)物可能會(huì)促進(jìn)GDH活性提高。在透色期時(shí)，芍藥已進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，葉片中的蛋白質(zhì)等含氮有機(jī)物開始水解成大量NH4+，光合能力下降，碳骨架受限制，在抑制GS活性的同時(shí)，提高了GDH活性[17]。此外，N450處理的GDH活性在各時(shí)期與別的處理差異一直比較大，除上述原因外，可能還與Nr還原太多NH4+有關(guān)，為緩解芍藥體內(nèi)氨毒害，GDH活性迅速升高[18]。

施氮對(duì)促成栽培芍藥的氮代謝有調(diào)節(jié)作用。在施氮300mg/L時(shí)，硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）等關(guān)鍵酶活性最高。說明適量施氮可以提高芍藥氮素同化能力，改善芍藥氮素營(yíng)養(yǎng)。