任敬一 付媛媛 荊瀟橦 蘇玉嬌 史曉瑞 杜玉茹 史海水

[摘要] 目的 探討慢性應(yīng)激致抑郁小鼠不同組織和血清中C型鈉尿肽（CNP）表達(dá)的影響。 方法 選取20只雄性ICR小鼠，并按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組和應(yīng)激組，每組10只。采用慢性輕度應(yīng)激（CMS）方法建立抑郁小鼠模型，經(jīng)動(dòng)物行為學(xué)檢測(cè)后取材，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法對(duì)小鼠海馬、肝、腎、心和血清中CNP進(jìn)行定量分析。 結(jié)果 行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，應(yīng)激組小鼠糖水偏愛(ài)值明顯減小，強(qiáng)迫游泳測(cè)試、懸尾測(cè)試的不動(dòng)潛伏期明顯縮短，強(qiáng)迫游泳的不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;兩組小鼠總攝水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。與對(duì)照組比較，應(yīng)激組小鼠心、腎和血清中CNP水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 慢性應(yīng)激可引起心、腎和血清中CNP水平顯著升高，提示外周組織的CNP表達(dá)變化可能與應(yīng)激致抑郁的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 抑郁癥;慢性應(yīng)激;鈉尿肽;C型鈉尿肽

[中圖分類(lèi)號(hào)] R395? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）08（a）-0026-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of C-type natriuretic peptide （CNP） expression in different tissues and serum of mice with chronic stress-induced depression. Methods Twenty male ICR mice were selected and divided into control group and stress group according to the random number table method with 10 mice in each group. Chronic mild stress （CMS） method was used to establish depression mice model. After animal behavior test， samples were taken and the levels of CNP in hippocampus， liver， kidney， heart and serum were quantitatively analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The results of behavioral test showed that compared with the control group， the preference value of sugar and water in stress group was significantly reduced， the immobility latency of forced swimming test and tail suspension test were significantly shortened， and the immobility time of forced swimming was significantly prolonged， the differences were statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in total water intake between the two groups （P > 0.05）. Compared with the control group， the levels of CNP in the heart， kidney and serum of the stress group increased significantly （all P < 0.05）. Conclusion Chronic stress can significantly increase the levels of CNP in heart， kidney and serum， suggesting that the changes of CNP expression in peripheral tissues may be related to the occurrence and development of stress-induced depression.

[Key words] Depression; Chronic stress; Natriuretic peptide; C-type natriuretic peptide

抑郁癥的發(fā)病機(jī)制和防治策略研究始終是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。大量流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[1-3]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激，尤其慢性應(yīng)激是抑郁癥發(fā)生的重要因素。慢性應(yīng)激在誘發(fā)抑郁癥發(fā)生的同時(shí)，也對(duì)機(jī)體外周組織產(chǎn)生顯著影響，是糖尿病、高血壓、心肌梗死、肝硬化等應(yīng)激相關(guān)疾病發(fā)生的重要誘因。值得注意的是，抑郁癥和上述應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生存在交互影響，應(yīng)激誘發(fā)的外周組織釋放功能分子變化，可進(jìn)一步通過(guò)內(nèi)分泌方式參與抑郁癥發(fā)生發(fā)展。抑郁癥常與冠心病、高血壓等多種疾病合并發(fā)生[4]。同時(shí)，抗抑郁策略可通過(guò)調(diào)控外周組織器官功能變化緩解個(gè)體的抑郁行為。鈉尿肽（natriuretic peptide，NPs）主要包括心房鈉尿肽（atrialnatriureticpeptide，ANP）、腦鈉尿肽（brain natriuretic peptide，BNP）、C型鈉尿肽（C-type natriuretic peptide，CNP）、Dendroaspis型鈉尿肽（dendroaspis natriuretic peptide，DNP）等。CNP廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、血管、血液和外周組織[5]，具有顯著的擴(kuò)張血管、抗焦慮、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和內(nèi)分泌等作用。目前，在應(yīng)激致抑郁發(fā)生過(guò)程中，不同組織CNP的表達(dá)變化規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)建立慢性輕度應(yīng)激致抑郁小鼠模型，分別檢測(cè)小鼠海馬、心、腎、肝和血清中CNP水平的變化，探討應(yīng)激對(duì)不同組織CNP表達(dá)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性7周齡ICR小鼠20只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，合格證號(hào)：11400700363290]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠飼養(yǎng)條件為室溫（22±1）℃，濕度（50±10）%，采用12 h/12 h的晝夜周期（8：00關(guān)燈，20：00開(kāi)燈），自由攝食飲水。

1.2 試劑

C型鈉尿肽酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：ml057895-C）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，所有操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 慢性輕度應(yīng)激小鼠模型的建立

小鼠經(jīng)適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，采用隨機(jī)隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對(duì)照組和應(yīng)激組，每組10只。對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng);應(yīng)激組小鼠進(jìn)行慢性應(yīng)激處理，每天隨機(jī)2種應(yīng)激刺激，應(yīng)激處理持續(xù)28 d。每天應(yīng)激刺激采用充分考慮急性和慢性應(yīng)激結(jié)合的原則，應(yīng)激刺激方式主要包括：冰水游泳5 min、夾尾1 min、束縛2 h、禁食24 h、禁水24 h、潮濕24 h、傾斜24 h、空籠24 h、晝夜顛倒。28 d應(yīng)激結(jié)束后進(jìn)行抑郁行為的測(cè)定，評(píng)價(jià)造模是否成功[6]。

1.4 行為學(xué)測(cè)定

參考課題組前期研究[6-7]，選取糖水偏愛(ài)測(cè)試、懸尾測(cè)試和強(qiáng)迫游泳測(cè)試評(píng)價(jià)小鼠的抑郁樣行為學(xué)。

1.4.1 糖水偏愛(ài)測(cè)試? 整個(gè)測(cè)試分為適應(yīng)和測(cè)試兩個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)前48 h，訓(xùn)練小鼠適應(yīng)含糖飲水，每籠放置2瓶1%蔗糖水。48 h后小鼠禁食水24 h處理。每只小鼠單籠放置，每籠給予事先準(zhǔn)備好的2瓶水，其中1瓶為1%蔗糖水，1瓶為純水，12 h時(shí)交換2個(gè)水瓶位置，24 h時(shí)計(jì)算喝水量?？倲z水量=糖水消耗量+普通水消耗量;糖水偏愛(ài)值=糖水消耗量/總攝水量。

1.4.2 懸尾測(cè)試? 將小鼠倒吊于距地面60 cm的橫桿上6 min，小鼠的固定位點(diǎn)為距離尾稍1 cm處，觀察記錄前2 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)潛伏期和后4 min小鼠總不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)狀態(tài)定義為小鼠停止掙扎，軀體呈放松狀態(tài)。

1.4.3 強(qiáng)迫游泳測(cè)試? 將小鼠單獨(dú)置于水深15 cm的玻璃缸內(nèi)（高20 cm，直徑14 cm），水溫（22±1）℃，游泳6 min，觀察記錄前2 min內(nèi)小鼠的不動(dòng)潛伏期和后4 min內(nèi)小鼠在水中總不動(dòng)時(shí)間。漂浮狀態(tài)時(shí)間定義為小鼠微蜷軀體，四肢尤其是后肢無(wú)大幅度擺動(dòng)。

1.5 血清、組織樣本制備與ELISA檢測(cè)

行為學(xué)測(cè)試評(píng)價(jià)造模成功后，于末次測(cè)試結(jié)束后第2天，摘除眼球取血，室溫靜置1 h，2000 r/min離心10 min，離心半徑7 cm，收集血清，備用。小鼠斷頭取腦，分離海馬組織，取心、肝、腎組織，液氮快速冷凍后于-80℃冰箱凍存，備用。組織蛋白提取、定量操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，ELISA檢測(cè)操作按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布的改用中位數(shù)或四分位數(shù)間距[M（QR）]表示，兩組間比較采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)（秩和檢驗(yàn)）。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠抑郁樣行為比較

應(yīng)激組小鼠糖水偏愛(ài)值較對(duì)照組明顯減?。≒ < 0.05），且兩組糖水測(cè)試中總攝水量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;應(yīng)激組小鼠懸尾測(cè)試的不動(dòng)潛伏期、不動(dòng)總時(shí)間較對(duì)照組均明顯縮短，且不動(dòng)總時(shí)間呈延長(zhǎng)的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;應(yīng)激組強(qiáng)迫游泳測(cè)試的不動(dòng)潛伏期較對(duì)照組明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），但兩組強(qiáng)迫游泳測(cè)試的不動(dòng)總時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組小鼠海馬、心、肝、腎和血清CNP含量比較

經(jīng)28 d慢性應(yīng)激處理后，應(yīng)激組小鼠心、腎和外周血中CNP水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），且海馬和肝中CNP水平呈下降趨勢(shì)。見(jiàn)表2。

3 討論

機(jī)體的應(yīng)激效應(yīng)具有廣泛性和非特異性。除抑郁癥外，長(zhǎng)期慢性應(yīng)激往往也是肝臟疾病、心腦血管疾病等的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[1-3]。抑郁癥與多種慢性疾病共患已經(jīng)引起廣泛關(guān)注。本研究采用ELSIA法檢測(cè)CMS后小鼠海馬、心、腎、肝等不同組織和血清中CNP水平的變化，結(jié)合行為學(xué)測(cè)試結(jié)果，表明抑郁小鼠心、腎、血清中CNP水平均明顯升高，但其在海馬和肝中均呈下降趨勢(shì)。

經(jīng)典的抑郁癥病因?qū)W主要涉及遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、神經(jīng)再生損傷和神經(jīng)過(guò)度炎癥等[8]。慢性應(yīng)激在導(dǎo)致抑郁行為的同時(shí)，也會(huì)造成肝臟、心血管等外周組織結(jié)構(gòu)和功能的損傷。同時(shí)，某些藥物/策略可通過(guò)改善外周組織器官功能發(fā)揮顯著的抗抑郁作用，提示在應(yīng)對(duì)應(yīng)激的過(guò)程中，機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織存在交互作用，對(duì)外周組織的調(diào)節(jié)有可能成為抑郁癥防治的重要方向[9-11]。隨著對(duì)抑郁癥研究的不斷深入，外周組織可通過(guò)釋放功能分子入血，并以內(nèi)分泌方式隨血液循環(huán)到特定靶器官發(fā)揮作用。運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素，直接通過(guò)血腦屏障促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生，改善小鼠抑郁行為[12]，而外源性補(bǔ)充乳酸也可以產(chǎn)生顯著的抗抑郁作用[13]，進(jìn)一步提示外周組織可通過(guò)內(nèi)分泌方式參與對(duì)抑郁行為的調(diào)節(jié)。

NPs家族成員眾多，ANP、BNP與焦慮、抑郁、學(xué)習(xí)記憶和成癮等中樞神經(jīng)功能調(diào)控密切相關(guān)，而CNP的功能研究相對(duì)較少。ANP是垂體-腎上腺皮質(zhì)激素釋放的肽能拮抗劑，參與個(gè)體情緒調(diào)節(jié)[14]。He等[15]報(bào)道，大鼠中樞ANP給藥能產(chǎn)生明顯的抗焦慮作用。最新流行病學(xué)研究[16]發(fā)現(xiàn)，抑郁的發(fā)生可能與兒童期不良經(jīng)歷導(dǎo)致ANP水平下降有關(guān)。與ANP相似，Strohle等[17]發(fā)現(xiàn)BNP均具有明顯的抗焦慮作用。最近的一項(xiàng)流行病學(xué)資料[18]顯示，通過(guò)對(duì)529例輕度抑郁的患者運(yùn)用焦慮、抑郁量表進(jìn)行評(píng)分，線性回歸模型揭示了N末端前腦鈉肽（NT-proBNP）水平與焦慮、抑郁、疲憊等消極情感呈負(fù)相關(guān)，并推測(cè)NT-proBNP可能作為評(píng)估社會(huì)心理狀況的一個(gè)重要預(yù)測(cè)因子。CNP作為鈉尿肽家族的重要成員，其結(jié)構(gòu)與ANP相似，功能卻有顯著差異。運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)可通過(guò)上調(diào)心肌CNP及其受體NPR-B的表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)作用[19]，基因敲低CNP阻斷NPRB/cGMP信號(hào)通路，從而加重大鼠心肌損傷并引起心室重構(gòu)[20]。腎臟組織中CNP的表達(dá)受其受體NPR-B和NPR-C調(diào)控，且與腎病患者自主神經(jīng)功能障礙相關(guān)[21]。CNP在非酒精性脂肪肝炎小鼠肝臟內(nèi)皮細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)，具有抗纖維化和抗炎作用[22]。以上研究提示，CNP可能作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子拮抗外周器官損傷，cGMP信號(hào)通路可能參與其中。Decker等[23]發(fā)現(xiàn)，海馬中CNP刺激cGMP通路后觀察到的突觸效應(yīng)，可能是肽類(lèi)激素對(duì)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響，提示CNP可影響神經(jīng)細(xì)胞的可塑性，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[24]。抑郁癥可通過(guò)NPs/NPRs信號(hào)通路使胃腸道間質(zhì)細(xì)胞減少[25]，CNP可與鈉尿肽受體作用明顯減少干細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而改善胃平滑肌細(xì)胞的功能，提示CNP在抑郁的發(fā)生發(fā)展中也可能發(fā)揮重要的作用。本研究采用慢性應(yīng)激小鼠抑郁模型，首次發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激致抑郁小鼠心、腎和血清中CNP顯著增加。外周組織增加的CNP是否參與抑郁的發(fā)生發(fā)展，是否可作為應(yīng)激致抑郁癥診斷標(biāo)志物等，均值得進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Dyussenova L，Pivina L，Semenova Y，et al. Associations between depression，anxiety and medication adherence among patients with arterial hypertension：Comparison between persons exposed and non-exposed to radiation from the Semipalatinsk Nuclear Test Site [J]. J Environ Radioact，2018，195：33-39.

[2]? 方飛.舍曲林聯(lián)合心理療法治療46例冠心病合并抑郁癥患者的臨床研究[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2017，15（7）：1204-1206.

[3]? 鄭宋宋，徐亞青，周玉琴，等.糖尿病腎病合并抑郁癥危險(xiǎn)因素分析[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2018，28（10）：878-880.

[4]? Patel R，Shristi S，Hina S. Comorbidities and Consequences in Hospitalized Heart Failure Patients with Depression [J]. Cureus，2018，10（8）：e3193.

[5]? 劉鵬，姚睿智，劉洋，等.冷應(yīng)激對(duì)大鼠外周組織中葡萄糖代謝的影響[C]//中國(guó)生理學(xué)會(huì)內(nèi)分泌代謝、比較生理與應(yīng)激生理學(xué)術(shù)會(huì)議，2017.

[6]? Piantino J，Goldenberg F，Pytel P，et al. Progressive intracranial fusiform aneurysms and T-cell immunodeficiency [J]. Pediatr Neurol，2013，48（2）：130-134.

[7]? Serra R，Buffone G，F(xiàn)alcone D，et al. Chronic venous leg ulcers are associated with high levels of metalloproteinases-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin [J]. Wound Repair Regen，2013，21（3）：395-401.

[8]? 牛雅娟.《中國(guó)抑郁障礙防治指南》藥物治療解讀[J].臨床藥物治療雜志，2018，16（5）：6-8.

[9]? 顧思?jí)?，李洋，杜文東.《內(nèi)經(jīng)》理論指導(dǎo)抑郁癥從肝辨治的探討[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（2）：420-421.

[10]? Liu X，Shi S，Yang H，et al. The activation of N-methyl-d-aspartate receptors downregulates transient outward potassium and L-type calcium currents in rat models of depression [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2017，313（2）：C187-C196.

[11]? 胡智玲，楊爽，杜玉茹，等.應(yīng)激致抑郁行為小鼠血清TPO和ANG的變化[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，39（8）：887-889.

[12]? Yau S，Li A，Hoo R，et al. Physical exercise-induced hippocampal neurogenesis and antidepressant effects are mediated by the adipocyte hormone adiponectin [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2014，111（44）：15 810-15 815.

[13]? Karnib N，El-Ghandour R，El HL，et al. Lactate is an antidepressant that mediates resilience to stress by modulating the hippocampal levels and activity of histone deacetylases [J]. Neuropsychopharmacology，2019，44（6）：1152-1162.

[14]? Kellner M，Wiedemann K，Holsboer F. Atrial natriuretic factor inhibits the CRH-stimulated secretion of ACTH and cortisol in man [J]. Life Sci，1992，50（24）：1835-1842.

[15]? He W，Zhou Q，Yu S，et al. Mechanism on atrial natriuretic peptide receptor in anti-anxiety with acupuncture based on its tranquilizing effect [J]. Zhongguo Zhen Jiu，2015，35（1）：101-104.

[16]? Kaczmarczyk M，Otte C，Wiedemann K，et al. Major depression and atrial natriuretic peptide：The role of adverse childhood experiences [J]. Psychoneuroendocrinology，2018，101：7-11.

[17]? Strohle A，Jahn H，Montkowski A，et al. Central and peripheral administration of atriopeptin is anxiolytic in rats [J]. Neuroendocrinology，1997，65（3）：210-215.

[18]? Fangauf S，Herbeck B，Meyer T，et al. Associations of NT-proBNP and parameters of mental health in depressed coronary artery disease patients [J]. Psychoneuroendocrinology，2018，96：188-194.

[19]? 陸矯.C型利鈉肽及受體在運(yùn)動(dòng)預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)心肌保護(hù)效應(yīng)中的變化及機(jī)制[D].上海：上海體育學(xué)院，2015.

[20]? Wu L，Zhang Q，Zhang S，et al. Effects of gene knockdown of CNP on ventricular remodeling after myocardial ischemia-reperfusion injury through NPRB/Cgmp signaling pathway in rats [J]. J Cell Biochem，2018，119（2）：1804-1818.

[21]? Wang L，Liu W，Yu Y，et al. Increased circulating bioactive C-type natriuretic peptide is associated with reduced heart rate variability in patients with chronic kidney disease [J]. BMC Nephrol，2018，19（1）：50.

[22]? Bae C，Hino J，Hosoda H，et al. C-type natriuretic peptide （CNP） in endothelial cells attenuates hepatic fibrosis and inflammation in non-alcoholic steatohepatitis [J]. Life Sci，2018，209：349-356.

[23]? Decker J，Wojtowicz A，Heinemann U，et al. C-Type natriuretic peptide modulates pre- and postsynaptic properties in hippocampal area CA1 in vitro[J]. Biochem Biophys Res Commun，2008，377（3）：820-825.

[24]? Decker J，Wojtowicz A，Ul H，et al. C-type natriuretic peptide decreases hippocampal network oscillations in adult rats in vitro [J]. Neuroscience，2009，164（4）：1764-1775.

[25]? Lin X，Tang X，Cai Z，et al. NPs/NPRs Signaling Pathways May Be Involved in Depression-Induced Loss of Gastric ICC by Decreasing the Production of mSCF [J]. PLoS One，2016，11（2）：e149031.

（收稿日期：2019-01-18? 本文編輯：王? ?蕾）