李志剛, 張宇靖, 張 晨, 光翠娥
(食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇 無錫214122)
苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)是一種由苯丙氨酸羥化酶 (phenylalanine hydroxylase,PAH)功能障礙或四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)合成酶/二氫生物蝶呤(dihydrobiopterin,BH2)還原酶缺陷而導(dǎo)致的常染色體隱性遺傳氨基酸代謝障礙性疾病[1-3]。飲食治療即控制患者日常飲食中苯丙氨酸攝入量,是目前最主要最有效的治療方式[4-5]。常見的由除苯丙氨酸外的其他游離氨基酸混合而成的配方食品,氣味難以接受,且食用后易造成人體滲透壓過高而導(dǎo)致腹瀉[6]。采用內(nèi)肽酶和外肽酶分步水解的方法釋放游離苯丙氨酸或產(chǎn)生苯丙氨酸處于末端的肽鏈,經(jīng)吸附去除苯丙氨酸后產(chǎn)物可用于為PKU患者制備特殊醫(yī)學(xué)配方食品。最常見最有效的吸附劑為活性炭。
日本學(xué)者Yamashita[7]和國內(nèi)學(xué)者周志偉[6]分別以濃縮魚蛋白和酪蛋白為原料,通過酶法水解再經(jīng)一定方式分離苯丙氨酸制備了低苯丙氨酸肽。除動物蛋白源外,小麥蛋白[8]、大米蛋白[9]及玉米蛋白[10]等也被用于制備此類肽。
作者以山杏仁蛋白為原料,通過酶法水解吸附苯丙氨酸制備低苯丙氨酸肽,為山杏仁的精深加工提高附加值提供依據(jù),同時為開發(fā)低/無苯丙氨酸肽特殊醫(yī)學(xué)配方食品提供原料來源。
1.1 材料與儀器
脫脂山杏仁粗蛋白粉:上海問森生物科技有限公司產(chǎn)品;Alcalase 2.4L、Flavourzyme 1000L (食品級):丹麥諾維信(Novozymes)公司產(chǎn)品;粉末活性炭:食品級,江蘇中遠(yuǎn)活性炭公司產(chǎn)品。
紫外可見光分光光度計(UV-1600):上海美普達(dá)儀器公司產(chǎn)品;pH計、離心機(jī):梅特勒特托利多(上海)有限公司產(chǎn)品;HS-7集熱式電磁攪拌器:IKA產(chǎn)品;K9840智能定氮儀、SH420石墨消解儀:海能儀器產(chǎn)品;DZF-6050電熱真空干燥箱:上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品;冷凍干燥機(jī):美國Labconoco公司產(chǎn)品;Agilent1100氨基酸專用高效液相色譜系統(tǒng):美國Agilent公司產(chǎn)品。
1.2 山杏仁蛋白的提取工藝脫脂山杏仁粗蛋白粉→調(diào)節(jié)pH至9.0→浸提→離心 (4000 r/min,20 min)→取上清液→調(diào)節(jié)pH至 4.1→離心 (5 000 r/min,15 min)→取沉淀→去離子水清洗→調(diào)節(jié)pH至7.0→真空冷凍干燥24 h→杏仁蛋白[11]。
1.3 常規(guī)成分測定
蛋白質(zhì)含量測定:GB5009.5—2010[12],凱氏定氮法;脂肪含量測定:GB/T5009.6—2003[13],索氏抽提法;水分含量測定:GB5009.3—2010[14],直接干燥法;灰分含量測定:GB5009.4—2010[15],550℃高溫灼燒法;酶活測定:QB/T 1803—93[16]。
1.4 水解度(Degree of hydrolysis,DH)的測定
水解度測定采用甲醛滴定法[17],公式如(1)所示:
式中:C為氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L;V1為所取水解液經(jīng)甲醛滴定至終點(diǎn)pH 9.2時所消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V2為空白經(jīng)甲醛滴定至pH 9.2時所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL;V為水解上清液體積,mL;M為水解樣品質(zhì)量,g;N為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),%;Htot為每克蛋白質(zhì)中所含肽鍵毫摩爾數(shù),對于杏仁蛋白,該值取7.58 mmol/g[18]。
1.5 Flavourzyme 1000L水解單因素實(shí)驗(yàn)
配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%山杏仁蛋白溶液,添加2 000 U/g Alcalase 2.4 L于60℃、pH 9.0條件下水解2 h后沸水浴滅酶10 min,待冷卻后用于外肽酶水解。外肽酶水解后沸水浴滅酶10 min,4 000 r/min離心10 min取上清液測定不同條件下DH。
1.5.1 pH對DH的影響于55℃下添加500 U/g Flavourzyme1000L, 分別于 pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5下水解120 min,測定不同pH下的DH。
1.5.2 溫度對于DH的影響于pH 7.5、酶添加量為 500 U/g,分別在 45、50、55、60 ℃溫度下繼續(xù)水解120 min,分別測定不同溫度下DH的變化。
1.5.3 酶添加量E/S對DH的影響于pH 7.5、55℃的水解條件下, 測定 500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000、3 500、4 000 U/g 酶添加量下水解 120 min后DH的變化。
1.5.4 水解時間對DH的影響于pH 7.5、50℃、酶添加量為3 000 U/g的條件下,分別測定30、60、90、120、150、180 min 不同水解時間的 DH, 確定水解時間。
1.6 Flavourzyme 1000L水解正交實(shí)驗(yàn)
通過單因素實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水解120 min后DH基本保持不變,因此采用三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)確定Flavourzyme 1000L的最佳水解條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計見表1。
1.7 苯丙氨酸的吸附
經(jīng)雙酶分步水解后水解液6 000 r/min離心20 min,取上清液添加10 g/dL食品級粉末活性炭,于35℃、pH 2.0吸附3 h。
表1 正交實(shí)驗(yàn)表Table 1 Factors and levels of orthogonal test
1.8 氨基酸組成分析
稱取100.0 mg肽粉于水解管內(nèi),加入8 mL 6 mol/L鹽酸,充氮封管后于120℃水解22 h,水解完成后取出冷卻加入4.8 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液中和鹽酸,再轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容。雙層濾紙過濾,取1 mL濾液于1.5 mL離心管內(nèi) 1 0000 r/min離心10 min,吸取400 μL上清液于樣品瓶中進(jìn)樣測定。
液相色譜條件:Agilent Hypersil ODS柱(5 μm,4.0 mm×250 mm); 流動相 A (pH=7.2):27.6 mmol/L醋酸鈉-三乙胺-四氫呋喃 (體積比為500∶0.11∶2.5);流動相 B(pH=7.2):80.9 mmol/L 醋酸鈉-甲醇-乙腈(體積比 1∶2∶2);采用梯度洗脫,洗脫程序:0 min,體積分?jǐn)?shù) 8%B;17.0 min,體積分?jǐn)?shù) 50%B;20.1 min,體積分?jǐn)?shù) 100%B;24.0 min,體積分?jǐn)?shù)0%B;流動相流量為1.0 mL/min;柱溫40℃;紫外檢測器(VWD)檢測波長為 338 nm,脯氨酸于262 nm處檢測。
提取所得山杏仁蛋白基本成分見表2。
表2 山杏仁蛋白質(zhì)基本成分Table 2 Main composition of apricot kernel protein
蛋白酶酶活測定結(jié)果見表3。
表3 蛋白酶酶活Table 3 Enzyme activity of different proteases
Alcalase2.4L是一種高效的細(xì)菌蛋白酶,能夠產(chǎn)生大量末端為疏水性氨基酸的肽類,所得水解液往往具有很強(qiáng)的苦味[19]。Flavourzyme 1000 L是一種兼具外肽酶和內(nèi)肽酶活性的復(fù)合蛋白酶,能有效切除肽鏈末端的疏水性氨基酸[20],并且能對肽類進(jìn)行進(jìn)一步水解,改善水解液的風(fēng)味。
2.2.1 pH對DH的影響從圖1可以看出,在選定的pH值下,隨著pH的上升DH逐漸提高,當(dāng)pH達(dá)到7.5左右時DH最大,超過7.5后由于蛋白酶的構(gòu)象發(fā)生變化,水解能力逐漸下降,因此選擇pH 7.5為其水解pH。
圖1 pH對DH的影響Fig.1 Effect of pH value on DH
2.2.2 溫度對DH的影響從圖2可以看出,在選擇的溫度參數(shù)下,DH逐漸提高,在50℃左右時水解能力最強(qiáng),超過50℃后由于高溫導(dǎo)致酶的構(gòu)象發(fā)生不可逆的改變,活性開始下降,因此選擇50℃為其水解溫度。
圖2 溫度對DH的影響Fig.2 Effect of temperature on DH
2.2.3 酶添加量對DH的影響從圖3可以看出,隨著酶濃度的上升DH逐漸增大,當(dāng)添加量增加到3 000 U/g左右時再增加酶濃度DH上升變緩,這可能是由于酶與底物的作用位點(diǎn)達(dá)到飽和狀態(tài),再增大酶濃度對于DH的提高貢獻(xiàn)有限,因此酶添加量選擇3 000 U/g。
圖3 酶添加量對DH的影響Fig.3 Effect of enzyme concentration on DH
2.2.4 水解時間對DH的影響從圖4可以看出,隨著時間的推移,能夠被Flavourzyme 1000L水解的位點(diǎn)逐漸減少,水解120 min后能夠被繼續(xù)水解的位點(diǎn)幾乎沒有,DH變化平緩,因此選擇120 min為其水解時間。
圖4 水解時間對DH的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH
正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。
通過極差分析可知,影響Flavourzyme 1000L水解山杏仁蛋白的主次因素為B>A>C(pH的影響最顯著,溫度次之,酶添加量影響最?。?,最佳因素水平組合為B2A2C2,即水解pH為7.5,水解溫度為50℃,酶添加量為3 000 U/g。經(jīng)測試在此工藝條件下水解120 min DH可達(dá)41.23%。
常見的用于分離苯丙氨酸的方法有膜分離法、離子交換法、凝膠過濾法等,而活性炭對苯丙氨酸有著特異性的吸附能力[21],具有廉價高效的特點(diǎn),因此選用食品級粉末活性炭去除苯丙氨酸。
雙酶分步水解后所得水解液,經(jīng)活性炭吸附苯丙氨酸后,真空抽濾去除活性炭,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空干燥72 h。氨基酸組成見表5。
表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of the orthogonal test
表5 肽粉氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of the peptide powder
經(jīng)計算,苯丙氨酸占總氨基酸質(zhì)量的0.32%,較山杏仁蛋白所含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.01%大幅降低,同時也低于周志偉[6]等人利用酪蛋白制備低苯丙氨酸肽中質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%。由于活性炭對含苯環(huán)氨基酸吸附選擇性較差,因此在利用此法生產(chǎn)低苯丙氨酸特殊食品時常常需要添加色氨酸和酪氨酸。此外,由于PKU患者飲食控制嚴(yán)格,導(dǎo)致體內(nèi)缺乏礦物質(zhì)和維生素,因此在利用此類肽制備低苯丙氨酸特殊食品時需要添加維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物等。
經(jīng)過試驗(yàn),F(xiàn)lavourzyme 1000 L水解山杏仁蛋白的最佳工藝條件為水解溫度50℃、pH 7.5、添加量3 000 U/g,水解120 min后DH可達(dá)41.23%。雙酶分步水解后,水解液經(jīng)活性炭吸附,最終所得肽粉中苯丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.32%。用此法所得低苯丙氨酸肽可通過補(bǔ)充部分氨基酸、維生素、礦物質(zhì)及碳水化合物等為PKU患者制備低苯丙氨酸特殊醫(yī)學(xué)配方食品。