鞠夢楠，祝 鋼，劉英杰，董亞博，蘭 天，江連洲，隋曉楠*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

Pickering乳液是一種不經(jīng)過常規(guī)乳化劑分子穩(wěn)定，而是通過被水和油部分潤濕的固體膠體顆粒充當(dāng)穩(wěn)定劑所形成的乳液[1]。水包油型Pickering乳液的主要穩(wěn)定機制發(fā)生在連續(xù)相或液滴表面，這取決于穩(wěn)定系統(tǒng)物質(zhì)組分的化學(xué)性質(zhì)。乳化劑和穩(wěn)定劑分別是水包油型乳液中的兩種成分。乳化劑是小的表面活性分子，能夠通過降低油-水界面處的表面張力和油表面的成膜性在短時間內(nèi)穩(wěn)定乳液[2]。穩(wěn)定劑通常是生物聚合物，例如蛋白質(zhì)或多糖，其通過改變水相黏度賦予乳液長期穩(wěn)定性[3]。

大豆分離蛋白主要由7S和11S構(gòu)成，在加熱時由于其球蛋白的組成和結(jié)構(gòu)，使埋藏在蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來，形成較大的聚集體顆粒，此顆?？梢宰鳛镻ickering乳液的穩(wěn)定劑[4]。

花青素是天然存在的生物活性物質(zhì)，廣泛分布在植物衍生的食品中[5]。同時，花青素是一種強有力的抗氧化劑，能夠保護(hù)人體免受自由基等有害物質(zhì)的損傷；此外，花青素還可以增強血管彈性，改善循環(huán)系統(tǒng)，抑制炎癥和過敏等?；ㄇ嗨刈鳛橐环N有良好蛋白親和性的小分子物質(zhì)，可通過共價結(jié)合與蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合體系[6]。

近年來，食品級納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液備受關(guān)注[7]。丁群文等[8]研究發(fā)現(xiàn)通過加熱處理大豆球蛋白形成的顆粒及其Pickering乳液，顆粒大小明顯增加，表面疏水性顯著提升；乳液的乳化性能和穩(wěn)定性得到提高。陳碩等[9]以植物球蛋白為材料制備荷載姜黃素蛋白納米復(fù)合物，研究表明，荷載后的蛋白比原蛋白乳化活性略低。Shah等[10]觀察到通過殼聚糖-三聚磷酸鹽納米顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液作為姜黃素的遞送系統(tǒng)，具有長期穩(wěn)定性。Zhou Fuzhen等[11]認(rèn)為麥醇溶蛋白與原花青素復(fù)合形成的Pickering乳液在貯藏過程中和模擬胃腸道消化過程中，脂質(zhì)氧化均被延遲。然而對于大豆分離蛋白與花青素共價復(fù)合后制備Pickering乳液的基礎(chǔ)特性尚不清楚。因此，本實驗主要研究大豆分離蛋白與不同濃度花青素共價復(fù)合后的顆粒制備Pickering乳液的基礎(chǔ)特性，以通過提供一種新型穩(wěn)定劑類型提高兩相濕潤性，為食品工業(yè)提供一種綠色健康的穩(wěn)定劑[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白由實驗室自制；大豆油 市購；花青素黑米提取物 陜西天之潤科技有限公司；氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純） 天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RO5磁力攪拌器、T18分散機 德國IKA公司；BX41正置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；WAT023635高效液相色譜儀美國Waters公司；C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，Sunfire） 美國Waters公司；固相萃取裝置上海興納生物科技有限公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

參考Huang Liurong等[13]的方法稍作修改。按1∶3（g/mL）的比例用正己烷對粉碎后得到的豆粉進(jìn)行3 次脫脂，并放在通風(fēng)櫥中除去正己烷。將除去正己烷的大豆粉末按1∶15（m/m）溶于蒸餾水中，用2 mol/L NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至8.0，并將所得漿液在25 ℃攪拌2 h，隨后在14 000 r/min離心15 min，收集上清液并用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 4.5，然后在4 000 r/min離心15 min。將獲得的沉淀物溶于蒸餾水中，用2 mol/L NaOH溶液中和至pH 7.0，在4 ℃用蒸餾水透析24 h，然后于-40 ℃預(yù)凍后凍干，研磨以得到大豆分離蛋白粉末。

1.3.2 花青素的純化與定量

花青素的提取參考Sui Xiaonan等[14]的方法，將黑米提取物粉末溶于蒸餾水中以制備濃縮的花青素溶液。將溶液減壓抽濾后，用Sep-Pak柱進(jìn)行固相萃取，隨后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑得到花青素提純樣品，將樣品存放于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)Sui Xiaonan等[15]的方法對花青素成分進(jìn)行定量。使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器在520 nm波長處檢測，使用花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)曲線對花青素中主要成分進(jìn)行定量。經(jīng)鑒定，黑米提取物粉末中主要成分為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，其純度為53.8 mg/mL。

1.3.3 大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合顆粒的制備

參照Liu Fu等[16]的方法稍作修改。稱取大豆分離蛋白粉末溶于0.01 mol/L磷酸緩沖溶液中（pH 7.0）配制成6 g/100 mL大豆分離蛋白溶液，室溫磁力攪拌2 h，在4 ℃放置過夜以使蛋白質(zhì)完全水合，加入疊氮化鈉0.2 g/L以抑制微生物生長。蛋白溶液與花青素共價復(fù)合參照Sui Xiaonan等[17]的方法，用0.1 mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 9.0，將花青素（0.05%、0.15%、0.25%，分別為顆粒1、顆粒2、顆粒3）按體積比例分別溶于蛋白溶液并在室溫下混合攪拌20 h，由此可得大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合物。其中，未經(jīng)處理的大豆分離蛋白溶液作為空白對照（顆粒0）。隨后，將所有樣品在95 ℃水浴15 min，然后立即在冰水浴中冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH 7.0，分別加入300 mmol/L NaCl溶液增加粒子強度。

1.3.4 大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合結(jié)合率的測定

參照Rodríguez等[18]的方法稍作修改，測定復(fù)合物中花青素的結(jié)合率。將復(fù)合后的樣品在4 ℃通過截留分子質(zhì)量為3.5 kDa的透析袋16 h，取其透析液用高效液相色譜-二極管陣列檢測器在520 nm波長處測量樣品中花青素吸光度，使用矢車菊素-3-葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算透析液濃度，復(fù)合物中花青素結(jié)合率按式（1）計算，每毫克大豆分離蛋白共價復(fù)合結(jié)合花青素的含量按式（2）計算：

式中：R花青素為復(fù)合物中花青素與蛋白結(jié)合率/%；M總花青素為總花青素含量/mg；M透析為透析液外未被結(jié)合的游離花青素含量/mg；MSPI為大豆分離蛋白含量/mg。

1.3.5 顆粒表征（粒徑、Zeta電位）

參考Yang Tao等[19]的方法稍加修改。利用Mastersizer 2000激光粒度儀對所有樣品進(jìn)行粒徑分布和Zeta電位測定。為避免多個顆粒的相聚產(chǎn)生影響，將樣品用0.01 mol/L緩沖溶液稀釋100 倍后測量粒徑，稀釋1 000 倍后過0.45 μm水系膜后測量電位。

1.3.6 蛋白顆粒清除自由基能力的測定

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除實驗，參照Zhang Qiaozhi等[20]的方法稍作修改?；旌现苽?.4 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液于黑暗中放置12～16 h形成ABTS工作液。稀釋ABTS工作液使其在630 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。樣品組的處理方法是向40 μL樣品溶液中加入4 mL稀釋的ABTS工作液；空白對照組的處理方法是向40 μL 0.01 mol/L緩沖溶液中加入4 mL稀釋的ABTS工作液，所有組別于黑暗處反應(yīng)6 min。在630 nm波長處測量所得溶液的吸光度。ABTS陽離子自由基清除率按式（3）計算：

式中：A空白為空白樣品的吸光度；A樣品為樣品的吸光度。

1.3.7 大豆分離蛋白-花青素顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的制備

參考De Folter等[21]的方法進(jìn)行修改。將大豆油滴入顆粒溶液中直至油相比（大豆油和蛋白復(fù)合液體積比）為0.2，用IKA分散機經(jīng)10 000 r/min分散2 min，制得新鮮乳液（乳液為對應(yīng)蛋白顆粒制備而成，分別為乳液0、乳液1、乳液2、乳液3）。具體流程參照圖1。

圖1 制備大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合納米顆粒及其Pickering乳液Fig. 1 Preparation of SPI-ACN covalent composite nanoparticles and Pickering emulsions

1.3.8 Pickering乳液類型判斷

通過觀察1滴乳滴在水或油中的分散情況，以此判斷乳液的類型。若將乳滴滴入水中迅速擴散，則證明是水包油（O/W）型乳液；反之，若將乳滴滴入油中迅速擴散，則證明是油包水（W/O）型乳液。

1.3.9 Pickering乳液表征（粒徑、Zeta電位）

參考Liu Fu等[22]的方法稍加修改，利用Mastersizer 2000激光粒度儀對所有樣品進(jìn)行粒徑分布和Zeta電位測定。

1.3.10 乳液微觀觀察

參考Wang Pengjie等[12]的方法稍加修改，以用于乳液微觀觀察。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸緩沖溶液將樣品適度稀釋，取1 滴適度稀釋的乳液放置在載玻片上，并用蓋玻片固定，在40 倍光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

所有的實驗至少進(jìn)行3 次重復(fù)，利用SPSS Statistics 24軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。采用Origin 8.5軟件進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合體系結(jié)合率分析

圖2 大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合體系結(jié)合率Fig. 2 Binding percentage of SPI-ACN covalent interactions

表1 大豆分離蛋白結(jié)合花青素的含量Table 1 Amounts of soy protein isolate combined with anthocyanins

復(fù)合物經(jīng)透析后可以獲得未與蛋白質(zhì)復(fù)合的游離花青素，通過測定游離花青素的含量，進(jìn)而計算出花青素-大豆分離蛋白的結(jié)合度。由圖2可知，共價復(fù)合后的樣品結(jié)合率在91%～96%之間，該結(jié)果與Rodríguez等[18]的結(jié)果一致，花青素在堿性環(huán)境下被氧化，生成的醌類物質(zhì)與大豆分離蛋白相互作用進(jìn)而生成共價鍵。同時，由表1可知，隨著花青素添加量的增加，共價復(fù)合的結(jié)合率也逐漸增加。當(dāng)花青素添加量增大4 倍（0.25%）時，每毫克大豆分離蛋白結(jié)合花青素的含量增加了51 倍。這一現(xiàn)象與Sui Xiaonan等[17]得到的結(jié)果一致。

2.2 蛋白納米顆粒粒徑分布

圖3 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合納米顆粒粒徑分布Fig. 3 Size distribution profiles of SPI-ACN nanoparticles

由圖3可以看出，蛋白顆粒主要呈單峰分布，未加入花青素的蛋白顆粒0分布在100～800 nm范圍內(nèi)，主要集中在300 nm，這主要是因為加熱后蛋白粒徑分布會向高尺寸轉(zhuǎn)移，加熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集。這一現(xiàn)象與Liu Fu等[16]觀察結(jié)果一致，與未加熱的蛋白質(zhì)相比，95 ℃加熱15 min的蛋白質(zhì)粒度明顯增大，加熱導(dǎo)致天然大豆蛋白成分聚集。加入花青素后，蛋白顆粒分布較為均一，該現(xiàn)象說明復(fù)合后溶液中的液滴具有相似的粒徑，穩(wěn)定性較強。與未加入花青素的蛋白顆粒相比，加入花青素的蛋白顆粒的粒徑稍有減?。?0～700 nm），Yuksel等[23]表示，蛋白與多酚復(fù)合后，會較為明顯地改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，改變?nèi)芤褐辛椒植记闆r，并且二者復(fù)合后粒徑分布會隨著多酚濃度的增大而左移，本實驗觀察結(jié)果與該現(xiàn)象一致。同時，隨著花青素添加量的增大，粒徑相對體積先增大后減小，當(dāng)花青素添加量為0.15%時（顆粒2），顆粒橫坐標(biāo)寬度最窄，相對體積最大，顆粒分布最為均一，這可能是因為蛋白質(zhì)與該濃度的花青素共價復(fù)合后，二者形成的物質(zhì)更為均一，內(nèi)部連接更為緊密，因此改善了納米顆粒粒徑分布。Wang Xiaoya等[24]研究發(fā)現(xiàn)，pH 8.0時表沒食子兒茶素沒食子酸酯與α-乳白蛋白共價復(fù)合后顯著改善了α-乳白蛋白的粒徑分布，使乳白蛋白粒徑分布更為均一。

2.3 蛋白納米顆粒Zeta電位分析

圖4 大豆分離蛋白-花青素復(fù)合納米顆粒Zeta電位Fig. 4 Zeta potential of SPI-ACN nanoparticles

如圖4所示，未加入花青素的蛋白顆粒0呈現(xiàn)較低的負(fù)電性。與花青素共價復(fù)合后，蛋白顆粒的Zeta電位絕對值開始增大。參考Jiang Lianzhou等[25]的結(jié)論，可能是由于花青素帶負(fù)電荷，當(dāng)pH 7.0時，花青素中的酚羥基去質(zhì)子化，由此產(chǎn)生的氧中心輸出高密度負(fù)電荷，與蛋白的正電基團(tuán)結(jié)合，使得大豆蛋白的負(fù)電荷相對增加。此外，因為與花青素復(fù)合后，蛋白質(zhì)上帶正電荷的基團(tuán)較少暴露出來，從而使大豆蛋白負(fù)電性增強。與花青素共價復(fù)合后蛋白顆粒的穩(wěn)定性得到了顯著提升。同時，隨著花青素含量的提升，蛋白顆粒的電位絕對值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，此結(jié)果說明顆粒2的穩(wěn)定性優(yōu)于顆粒1和顆粒3，該結(jié)果與蛋白顆粒粒徑結(jié)果一致。

2.4 蛋白納米顆?？寡趸芰Ψ治?/h3>

圖5 大豆分離蛋白-花青素納米顆粒清除ABTS陽離子自由基能力Fig. 5 ABTS radical cation scavenging capacity of SPI-ACN nanoparticles

由圖5可見，未添加花青素的顆粒0自由基清除能力較低，僅為27.78%。與未添加花青素的對照組相比，添加花青素的顆粒，隨著花青素添加量的增加，蛋白顆粒自由基清除能力先上升后略有下降，且顆粒1～3號樣品自由基清除能力均明顯高于顆粒0（P＜0.05）。這說明蛋白與花青素共價復(fù)合后，花青素抗氧化，清除自由基的能力得到體現(xiàn)。其中顆粒2自由基清除能力最強，為70.37%。這說明添加量0.15%的花青素與蛋白共價復(fù)合后形成更好的相互作用，形成更穩(wěn)定的顆粒體系。這一現(xiàn)象與Zhang Yan等[26]研究結(jié)果一致，花青素與蛋白結(jié)合后形成的乳液同樣具有顯著的抗氧化性，其清除自由基的能力高于未添加花青素制備的乳液。所以，當(dāng)花青素的添加量在一定范圍內(nèi)時，可以明顯增強蛋白顆粒的自由基清除能力，這主要是因為花青素與蛋白結(jié)合后形成了顆粒度更均一，粒度更小，電位絕對值更大的顆粒。

2.5 乳液的類型

通過觀察乳滴在水或者油中的分散情況判斷乳液的類型（圖6）。把大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合顆粒穩(wěn)定的Pickering乳液滴到水中后，液滴快速分散，證明此乳液是O/W型乳液。

圖6 大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合Pickering乳液Fig. 6 Pickering emulsions stabilized by SPI-ACN covalent composite nanoparticles

2.6 乳液粒徑分析

圖7 Pickering乳液粒徑分布Fig. 7 Droplet size distribution profiles of Pickering emulsions

由圖7可知，未添加花青素的Pickering乳液粒徑范圍主要分布在10～60 μm之間；添加花青素的Pickering乳液粒徑范圍主要分布在4～20 μm之間?？梢娞砑踊ㄇ嗨睾笕橐毫接邢蜃筠D(zhuǎn)移的趨勢。這說明花青素與大豆分離蛋白共價復(fù)合后，可有效改善共價體系的粒徑分布。Jiang Lianzhou等[25]研究也表明此觀點，花青素可明顯改善復(fù)合體系的粒度分布。此外，乳液2呈單峰分布且相對體積最大，說明乳液2與其他3 種樣品相比形成了更加均一穩(wěn)定的乳液，說明該添加量的花青素與蛋白復(fù)合后形成的乳液穩(wěn)定性最好。這因為顆粒2較穩(wěn)定，所以形成的乳液較穩(wěn)定。與Karnaukhova等[27]研究發(fā)現(xiàn)向大分子蛋白質(zhì)中添加適量的小分子物質(zhì)可以改善蛋白質(zhì)乳滴分布的結(jié)論相符合。

2.7 乳液Zeta電位分析

圖8 Pickering乳液Zeta電位Fig. 8 Zeta potential of Pickering emulsions

如圖8所示，Zeta電位負(fù)值證明乳液表面存在陰離子[28]。未與花青素復(fù)合的乳液0 Zeta電位為-12.37 mV，與花青素復(fù)合后的乳液Zeta電位絕對值都顯著增加（P＜0.05）。其中，乳液2 Zeta電位絕對值增加最為明顯，為-25.47 mV，說明乳液2較為穩(wěn)定，這也與乳液粒徑結(jié)果一致。由圖8可知，隨著花青素添加量的增大，乳液Zeta電位呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。當(dāng)花青素添加量達(dá)到0.25%時，乳液3 Zeta電位的絕對值有所下降，但仍大于未與花青素復(fù)合的乳液0。這可能是因為，大豆分離蛋白與花青素共價復(fù)合后，通過共價鍵之間的相互作用，使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，負(fù)電荷露出。同樣地與Mikulcová等[29]研究發(fā)現(xiàn)，乳液Zeta負(fù)電位絕對值越大，乳液的穩(wěn)定性越優(yōu)良的現(xiàn)象相符合。乳液Zeta電位的結(jié)果與乳液粒徑結(jié)果一致，說明大豆分離蛋白-花青素共價復(fù)合穩(wěn)定的Pickering乳液通過影響乳液的Zeta電位值優(yōu)化乳液的穩(wěn)定性。

2.8 Pickering乳液光學(xué)顯微鏡觀察分析

圖9 Pickering乳液光學(xué)顯微鏡觀察圖（×40）Fig. 9 Observation of Pickering emulsions under optical microscope (× 40)

由圖9可知，全部樣品微觀結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)液滴狀，乳液2的液滴最為均勻，沒有產(chǎn)生聚集，乳滴與乳滴之間重疊部分較少，排列整齊，與之前粒徑、電位結(jié)果一致。這一現(xiàn)象與Wang Pengjie等[12]得到相似的結(jié)論，經(jīng)過京尼平與酪蛋白共價交聯(lián)穩(wěn)定的Pickering乳液比只由酪蛋白形成的Pickering乳液表現(xiàn)出更好的抗絮凝穩(wěn)定性。較為明顯的是乳液0的液滴相比于乳液1～3大很多，相比于乳液0，其他3 種乳液的乳滴更小，穩(wěn)定性更強。已有研究表明，這是由于大豆分離蛋白穩(wěn)定的乳液中，水相中未吸附的蛋白分子增加了油滴之間的吸引力，進(jìn)而引起蛋白分子的滲透作用，這種滲透作用會加速絮凝過程，形成較大乳滴[30]。

3 結(jié) 論

大豆分離蛋白與花青素共價復(fù)合顆粒為Pickering乳液穩(wěn)定劑，制備出無表面活性劑的食品級Pickering乳液。通過調(diào)節(jié)花青素添加量，得到了粒度較小的納米顆粒，并以該添加量的顆粒制備出穩(wěn)定性較強的水包油型Pickering乳液。

當(dāng)花青素添加量為0.15%時，納米顆粒粒度較小，僅為200 nm；Zeta電位絕對值最大為18.56 mV；同時該添加量下蛋白顆粒自由基清除能力最強。根據(jù)光學(xué)顯微鏡觀察可知，由此納米顆粒制備的Pickering乳液最為穩(wěn)定，沒有產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。

與未添加花青素的空白對照組相比，添加花青素的實驗組納米顆粒在粒徑分布、Zeta電位、自由基清除能力都優(yōu)于空白組；同時，實驗組制備的Pickering乳液在光學(xué)顯微觀察中，顯示出優(yōu)良的穩(wěn)定性，而對照組則較易聚集。