林萍 高明清 陳永明

摘要：提出一種利用近紅外光譜技術(shù)快速鑒別轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本的新方法，采用近紅外光譜儀獲取轉(zhuǎn)Bt基因的水稻種子克螟稻1號、克螟稻2號及其親本秀水11的反射光譜特征曲線，采用ISOMAP流形降維法對采集到的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性降維，提取45個特征波長，用于建模輸入，利用最小二乘支持向量機(jī)方法建立光譜反射率值與類別值之間的預(yù)測模型。3種水稻種子樣本數(shù)均為350個，共計1 050個樣本，將其分成900個訓(xùn)練集樣本和150個預(yù)測集樣本，預(yù)測準(zhǔn)確率達(dá)94.67%。說明本研究提出的方法對于轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本具有很好的分類和鑒別能力，且檢測過程比傳統(tǒng)理化檢測手段簡單，操作性強(qiáng)。該研究為今后轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的快速無損檢測提供了新的方法。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻;ISOMAP流形降維;最小二乘支持向量機(jī);近紅外光譜技術(shù)

中圖分類號： O657.33;S127 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0072-03

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，它在提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、增強(qiáng)農(nóng)作物的抗逆性和抗蟲等方面成績顯著，越來越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品開始出現(xiàn)在人們的餐桌上。中國是產(chǎn)糧大國，水稻產(chǎn)量居全球首位，但有75%的水稻受水稻螟蟲蟲害，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的迅猛發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)，種植Bt水稻可以減少80%的殺蟲劑用量，并且給農(nóng)戶帶來40億美元/年的收益[1-2]。目前，轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品檢測技術(shù)也逐漸受到研究人員關(guān)注，綜合各國現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法，主要有DNA檢測法和蛋白質(zhì)檢測法兩大類[3]，常用的包括核氣相質(zhì)譜法[4]、酸印記法（southern blot）[5]、酶聯(lián)免疫吸附法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、蛋白質(zhì)印記法[6]等，各檢測方法的特點如表1所示。這些化學(xué)分析法由于耗時長、操作復(fù)雜、易造成環(huán)境污染，難以滿足實際應(yīng)用中在線快速準(zhǔn)確鑒別的需要。因此，尋求一種高效、快速、準(zhǔn)確的檢測方法對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的鑒定識別顯得尤為重要。

目前，近紅外光譜分析技術(shù)已經(jīng)開始應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的檢測應(yīng)用研究中。芮玉奎等利用近紅外光譜分析技術(shù)分析了3 500～12 000 cm-1區(qū)間的波譜信息，對轉(zhuǎn)基因玉米及其親本進(jìn)行了識別分析，得到了很高的識別精度[7]。Hu等利用近紅外透射光譜數(shù)據(jù)建立了轉(zhuǎn)基因白楊樹的識別模型，結(jié)果證明該方法可以有效地識別轉(zhuǎn)基因樹木[8]。愛荷華州立大學(xué)谷物品質(zhì)研究室利用傳統(tǒng)種植大豆和Roundup Ready大豆的近紅外光譜在910～1 000 nm波長附近的1個偏移，成功地將傳統(tǒng)種植大豆和抗草甘膦大豆有效地區(qū)分開來[9]。翟亞鋒等利用近紅外光譜分析技術(shù)對轉(zhuǎn)基因小麥種子進(jìn)行判別分析，得到了滿意的效果[10]。朱文超等利用近紅外光譜實現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因水稻及其親本葉片的判別[11]，但針對轉(zhuǎn)基因水稻種子方面的報道較少，且在國內(nèi)外文獻(xiàn)中鮮有對轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子及其親本光的近紅外光譜特性進(jìn)行研究的報道。

本研究的目的是通過近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合現(xiàn)代化學(xué)計量學(xué)方法實現(xiàn)對轉(zhuǎn)Bt基因水稻種子克螟稻1號和克螟稻2號及其親本秀水11的快速無損檢測。

1 試驗與方法

1.1 儀器設(shè)備

試驗數(shù)據(jù)的獲取采用美國ASD（Analytical Spectral Device，Boulder，USA）公司的Handheld Field Spec光譜儀，光譜分辨率為0.002 μm，光源采用14.5 V鹵素?zé)簦杉到y(tǒng)原理如圖1所示。因為轉(zhuǎn)Bt基因的水稻是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽胞桿菌殺蟲蛋白基因作為外源基因?qū)胨精@得的，因此試驗采集1.000～2.650 μm中紅外波段的漫反射光譜總計共1 050個樣本，每個樣本光譜掃描次數(shù)設(shè)定為30次并取平均值。選取900個樣本作為建模集樣本進(jìn)行訓(xùn)練，剩余150個作為預(yù)測集樣本，分析軟件采用Matlab R2016a（The Math Works，USA）。

1.2 樣品與數(shù)據(jù)采集

樣本均來自浙江大學(xué)水稻生物學(xué)國家重點實驗室，依次做好標(biāo)記并放入保鮮袋中，置于0 ℃氣候箱中保存。共計 1 050 個樣本，其中轉(zhuǎn)Bt基因水稻克螟稻1號和克螟稻2號以及親本秀水11樣本分別為350個。光譜數(shù)據(jù)采集和分析試驗于2016年8月在原農(nóng)業(yè)部光譜檢測重點實驗室進(jìn)行，不同品種樣本的光譜采集采用交替進(jìn)行的方式，每個樣本采集數(shù)據(jù)30次作平均處理并保存，所有測量都在相同的條件下進(jìn)行，溫度28 ℃，相對濕度65%。

1.3 流形降維法

由于近紅外光譜主要是倍頻和合頻的吸收，光譜信息重疊嚴(yán)重，用光譜技術(shù)精確定量樣本的特征屬性首先須要從復(fù)雜的光譜信息中提取出有用信息。本研究利用降維技術(shù)將高光譜數(shù)據(jù)投影到低維空間中，從而更有利于發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的聚類性質(zhì)[12]。目前常用的降維技術(shù)有主成分分析、多維尺度變換[13]等。這些方法多是基于線性降維技術(shù)，難以有效表達(dá)非線性高維數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征，它們構(gòu)造的歐式距離矩陣不能有效地將流形樣本點間的非線性關(guān)系反映出來，無法求解高維非線性數(shù)據(jù)集的本質(zhì)維數(shù)。等距映射（ISOMAP）[14]是一種新的非線性降維技術(shù)，該方法采用標(biāo)準(zhǔn)多維尺度變換算法獲得樣本間測地距離不變的低維流型，它從樣本局部空間出發(fā)，在保持?jǐn)?shù)據(jù)點的內(nèi)在幾何性質(zhì)（兩點間的測地距離）不變的基礎(chǔ)上，使用最近鄰圖中的最短路徑作為測地線距離，并作為多維尺度變換地輸入，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)嵌入在高維空間的低維坐標(biāo)。

1.4 最小二乘支持向量機(jī)

最小二乘支持向量機(jī)算法是在經(jīng)典支持向量機(jī)算法的基礎(chǔ)上改進(jìn)得到的，與傳統(tǒng)支持向量機(jī)不同的是最小二乘支持向量機(jī)算法只要求解一個線性方程組，相比于傳統(tǒng)支持向量機(jī)（SVM）算法須要求解非線性方程組而言要簡單得多[15]。本研究采用徑向基（RBF）核函數(shù)作為非線性函數(shù)，其參數(shù)的選擇采用格點搜索法和留一交叉驗證法對校正集樣本進(jìn)行訓(xùn)練，得到最佳參數(shù)γ和δ2值。γ值對改進(jìn)最小二乘支持向量機(jī)模型起至關(guān)重要的作用，決定結(jié)構(gòu)風(fēng)險最小化（SRM）和經(jīng)驗風(fēng)險最小化（ERM）之間的平衡。δ2直接影響初始的特征值和特征向量，用于控制函數(shù)回歸誤差，δ2值過小，易出現(xiàn)對樣本數(shù)據(jù)的過學(xué)習(xí)現(xiàn)象，反之則只出現(xiàn)欠學(xué)習(xí)現(xiàn)象。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的近紅外光譜圖

由于測量到的光譜在1 000～1 100 nm范圍內(nèi)存在較大的噪聲，因此選用1 100～2 500 nm波長范圍內(nèi)共計1 400個變量進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)Bt基因的水稻種子及其親本的近紅外吸收光譜如圖2所示，圖中橫坐標(biāo)為波長，縱坐標(biāo)為反射率。從圖2可以看出，3種水稻種子的光譜曲線趨勢非常相似，只從光譜特征上難以區(qū)分不同種類的轉(zhuǎn)基因水稻種子。因此，須要運(yùn)用相應(yīng)的化學(xué)計量學(xué)建模方法對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2.2 非線性特性檢測

本研究采用2種定量的數(shù)值統(tǒng)計方法（Durbin-Watson測試法[16-17]、Run測試法[18]）來檢查光譜數(shù)據(jù)的非線性程度。經(jīng)計算，Durbin-Watson測試值d為1.548，大于臨界值 dH=1.40，表明模型殘差不相關(guān)存在非線性結(jié)構(gòu)，Run測試法的檢驗值Z為2.316，大于臨界值1.96。試驗結(jié)果表明，采集到的光譜數(shù)據(jù)存在顯著的非線性結(jié)構(gòu)。此外，增強(qiáng)偏殘差圖分析法[19]也用來確定采集到的光譜數(shù)據(jù)中是否存在非線性結(jié)構(gòu)。圖3為第1主成分（PC1）與前6個主成分殘差多項式擬合的結(jié)果，由此可以看出數(shù)據(jù)集存在顯著的非線性結(jié)構(gòu)。

2.3 線性與非線性降維方法比較

圖4是分別采用線性降維方法PCA、多維尺度變換以及非線性降維方法ISOMAP提取的特征波長，結(jié)合最小二乘支持向量機(jī)回歸分析方法得到的建模集樣本的預(yù)測精度與本真維數(shù)之間的關(guān)系曲線。使用ISOMAP算法進(jìn)行降維時有2個參數(shù)須要調(diào)整，分別是鄰域參數(shù)k和樣本本真維數(shù)d。在不同參數(shù)組合下，基于ISOMAP的最小二乘支持向量機(jī)模型得到不同的預(yù)測效果。本研究參數(shù)優(yōu)化采用網(wǎng)格搜索法和留一法驗證法，對光譜數(shù)據(jù)建模集分別選取k∈[5，20]、d∈[5，100]作ISOMAP降維，再用最小二乘支持向量機(jī)進(jìn)行回歸建立轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的校正模型。從圖4可以看出，利用非線性流形降維方法ISOMAP提取的特征波長進(jìn)行回歸預(yù)測得到的精度比線性降維方法PCA和多維尺度變換高。采用ISOMAP非線性流形降維方法預(yù)測精度隨著維數(shù)的增加逐漸提高，當(dāng)鄰域參數(shù)k=5、本真維數(shù)d=45時，預(yù)測精度達(dá)到最高，為94.67%。2種線性降維方法PCA和多維尺度變換提取的特征波長進(jìn)行回歸預(yù)測的效果相差不大，最高預(yù)測精度分別為75.31%和78.62%，對應(yīng)的特征波長維數(shù)分別為40和60。通過比較分析可得，非線性降維方法能夠更好地發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)集的聚類性質(zhì)，揭示實際數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)。

2.4 最小二乘支持向量機(jī)建模及預(yù)測

本研究采用了二步格點搜索法對參數(shù)γ和δ2進(jìn)行優(yōu)化，參數(shù)γ的選擇范圍設(shè)定為2-1～210，δ設(shè)定為2～215。尋優(yōu)過程由粗選和精選2個步驟組成：粗選搜索步長較大，最優(yōu)參數(shù)范圍由誤差等高線確立;精選在粗選基礎(chǔ)上，采用較小步長進(jìn)行搜索，最終確定最優(yōu)模型參數(shù)，尋優(yōu)結(jié)果得到最優(yōu)的γ和δ2分別為43.598和11.368。為了評估最小二乘支持向量機(jī)模型鑒別轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的魯棒性，計算了預(yù)測結(jié)果的混淆矩陣和精度-召回曲線。從圖5-a可以看出，最小

二乘支持向量機(jī)回歸模型對克螟稻2號和秀水11的分類精度達(dá)到了100%，所有的樣本都被正確判別出?？嗣?號有16%被誤判為秀水11。圖5-b是精度-召回曲線，平均準(zhǔn)確率是計算所有精度-召回曲線上的單點局部值的平均準(zhǔn)確度，考慮了樣本總體分類效果，計算得到MAP指數(shù)為 0.97。分類結(jié)果說明近紅外光譜技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本的無損、快速檢測。

3 結(jié)論

利用近紅外光譜技術(shù)對轉(zhuǎn)基因水稻種子及其親本進(jìn)行了判別研究。根據(jù)Durbin-Watson測試法和Run測試法檢查光譜數(shù)據(jù)的非線性程度，檢測結(jié)果表明，光譜數(shù)據(jù)中存在非線性結(jié)構(gòu)， 因此須要進(jìn)一步采用非線性流形降維ISOMAP法對近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，來獲取有效光譜信息，將ISOMAP提取的本真光譜結(jié)構(gòu)作為最小二乘支持向量機(jī)的輸入實現(xiàn)近紅外光譜的非線性建模，達(dá)到總體識別精度為 94.67%，平均準(zhǔn)確率指數(shù)為0.97，提出的檢測方法比常規(guī)的化學(xué)方法簡單、操作性強(qiáng)。本研究為流形學(xué)習(xí)算法引入近紅外光譜建模提供了一種有益嘗試，為今后轉(zhuǎn)基因水稻種子的快速無損檢測提供了新的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]俞 超，張 吉，葉生晅，等. Bt轉(zhuǎn)基因水稻生理生化特性研究初報[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：31-33.

[2]劉 凱，楊亞軍，田俊策，等. 不同氮肥水平下轉(zhuǎn)Bt基因水稻對褐飛虱和白背飛虱生態(tài)適應(yīng)性的繼代影響[J]. 中國水稻科學(xué)，2016，30（2）：200-209.

[3]謝小波，舒慶堯. 用Envirologix Cry1Ab/Cry1Ac試劑盒快速測定轉(zhuǎn)基因水稻Bt殺蟲蛋白含量的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，34（5）：465-468.

[4]Fiehn O，Kopka J，Trethewey R N，et al. Identification of uncommon plant metabolites based on calculation of elemental compositions using gas chromatography and quadrupole mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry，2000，72（15）：3573-3580.

[5]Milcamps A，Rabe S，Cade R，et al. Validity assessment of the detection method of maize event Bt10 through investigation of its molecular structure[J]. Journal of Agricultural&Food Chemistry，2009，57（8）：3156-3163.

[6]Margarit E，Reggiardo M I，Vallejos R H，et al. Detection of Bt transgenic maize in foodstuffs[J]. Food Research International，2006，39（2）：250-255.

[7]芮玉奎，羅云波，黃昆侖，等. 近紅外光譜在轉(zhuǎn)基因玉米檢測識別中的應(yīng)用[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2005，25（10）：1581-1583.

[8]Hu Z，Yeh T F，Chang H，et al. Elucidation of the structure of cellulolytic enzyme lignin[J]. Holzforschung，2006，50（4）：1040-1397.

[9]Zhou P P，Zhou R，Zhao Y F，et al. Contamination assessment of dietary ethyl carbamate in wine[J]. Chinese Journal of Food Hygiene，2008，20（3）：208-209.

[10]翟亞鋒，蘇 謙，鄔文錦，等. 基于仿生模式識別和近紅外光譜的轉(zhuǎn)基因小麥快速鑒別方法[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2010，30（4）：924-928.

[11]朱文超，成 芳. 轉(zhuǎn)基因水稻及其親本葉片的可見/近紅外光譜分析[J]. 光譜學(xué)與光譜分析，2012，32（2）：370-373.

[12]翁時鋒，張長水，張學(xué)工. 非線性降維在高維醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)處理中的應(yīng)用[J]. 清華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，44（4）：485-488.

[13]吳曉婷，閆德勤. 數(shù)據(jù)降維方法分析與研究[J]. 計算機(jī)應(yīng)用研究，2009，26（8）：2832-2835.

[14]汪洪橋，蔡艷寧，孫富春，等. 多尺度核方法的自適應(yīng)序列學(xué)習(xí)及應(yīng)用[J]. 模式識別與人工智能，2011，24（1）：72-81.

[15]楊國強(qiáng)，張淑娟，趙艷茹. 基于近紅外透射光譜的汾陽王酒快速鑒別[J]. 農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報，2013，44（增刊1）：189-193.

[16]Capron X，Walczak B，Noord O D，et al. Selection and weighting of samples in multivariate regression model updating[J]. Chemometrics&Intelligent Laboratory Systems，2005，76（2）：205-214.

[17]Kleinbaum D G，Kupper L L，Muller K E. Applied regression analysis and other multivariate models[J]. Technometrics，1978，31（1）：117-118.

[18]Walczak B，Jouanrimbaud D，Massart D L，et al. Comparison of multivariate calibration techniques applied to experimental NIR data sets[J]. Applied Spectroscopy，2000，54（4）：608.

[19]Kompany-Zareh M，Mirzaei S. Spectrophotometric resolution of ternary mixtures of pseudoephedrine hydrochloride，dextromethorphan hydrobromide，and sodium benzoate in syrups using wavelength selection by net analyte signals calculated with hybrid linear analysis[J]. Analytica Chimica Acta，2004，526（1）：83-94.