王利紅 張偉 陳章言

摘要：SIRT2作為第三類去乙酰化酶Sirtuins家族一員，通過催化不同的底物去乙?；瘏⑴c細胞周期調(diào)控、細胞代謝、細胞凋亡、基因沉默等許多生物學過程。在蘇姜豬14個組織樣中均檢測到SIRT2 mRNA的表達，其中在心臟、肌肉、肝臟和脂肪組織中的表達較豐富;SIRT2免疫陽性細胞主要分布于肌細胞、黏膜層細胞和脂肪細胞中，表明SIRT2在蘇姜豬組織中的表達具有廣泛性，且是許多生物學過程的重要參與因素之一。

關(guān)鍵詞：SIRT2基因;蘇姜豬;組織表達譜;免疫組化

中圖分類號： S828.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0055-04

SIRT2（silent mating type information regulation 2 homolog 2）是Sirtuins蛋白家族的一個成員，在動物組織中分布廣泛，通過催化不同的底物去乙酰化參與細胞周期調(diào)控、細胞代謝、細胞凋亡、基因沉默等許多生物學過程[1-2]。在體內(nèi)外試驗發(fā)現(xiàn)，抑制SIRT2基因的轉(zhuǎn)錄可以提高HIF1α的乙酰化水平，導致脂肪酸氧化和能量解偶聯(lián)下降，此外，SIRT2還可以去乙酰化作用PEPCK1基因，調(diào)節(jié)細胞對葡萄糖濃度變化的應答，表明SIRT2在調(diào)控糖脂代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[2-3]。截至目前，針對母豬組織中SIRT2表達定位的研究，特別是蘇姜豬的研究鮮有報道。本研究通過實時熒光定量和免疫組織化學方法檢測SIRT2在蘇姜豬組織中的表達分布，不僅豐富了SIRT2在豬各組織功能中的作用機制，而且對于深入探索SIRT2在蘇姜豬組織中的作用，通過分子育種技術(shù)持續(xù)選育提高蘇姜豬生產(chǎn)性能，提供新的理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

隨機選取飼養(yǎng)管理方式一致的6月齡健康蘇姜豬母豬3頭，進行屠宰。屠宰后分別采集心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、皮下脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮共14個組織樣各2份，一份置于液氮中保存，用于基因提取，另一份用PBS清洗后在4%多聚甲醛中固定24 h，制成石蠟組織切片，用于免疫組織化學檢測。

1.2 試驗方法

1.2.1 主要儀器和試劑 紫外分光光度計（Beckman公司），Quantstudio多重實時熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司），組織脫水機、包埋機和切片機（德國Leica公司）。TrIzol?Plus RNA Purification Kit和SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR，購于Invitrogen公司;RNase-Free DNase Set，購于Qiagen公司;Power SYBR?Green PCR Master Mix，購于Roche公司，Anti-SIRT2 antibody，購于ABCAM公司。

1.2.2 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Invitrogen公司總RNA提取試劑盒說明書操作，利用紫外分光光度計檢測RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄按照SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR試劑盒說明操作。反應條件為：25 ℃，10 min;50 ℃，30 min;85 ℃，5 min，于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中豬SIRT2基因序列（NM_001114271.1）設計引物，選擇β-actin作為內(nèi)參基因。采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8軟件進行定量PCR引物設計，引物序列見表1。

1.2.4 Real-Time PCR擴增體系和反應條件 Real-Time PCR反應體系（20.0 μL）含Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL、（10 μmol/L）Forward Primer 0.5 μL、（10 μmol/L）Reverse Primer 0.5 μL、cDNA 1.0 μL。反應條件為：95 ℃，1 min，95 ℃ 15 s，63 ℃ 25 s收集熒光40個循環(huán)。每個樣品重復3次。

1.2.5 免疫組化 將組織切片置于60 ℃恒溫箱中固定1 h后依次放入二甲苯、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇，用ddH2O洗滌?？乖迯秃?，ddH2O和PBST清洗，3% H2O2-甲醇溶液浸泡，15 min后用PBST浸泡并清洗。之后，用血清封閉切片，一抗4 ℃孵育過夜，室溫復溫1 h后，用PBST浸泡并清洗，加入酶標二抗室溫孵育，并用PBST浸泡并清洗，DAB顯色液顯色，中性樹膠封片。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 SIRT2基因的相對表達水平以2-ΔΔCT計算，應用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 蘇姜豬不同組織中SIRT2 mRNA表達量分析

采用相對定量法，以β-actin作為內(nèi)參基因，矯正不可控制因素，歸一化起始組織量，并定義心臟組織中的表達水平為1，以對SIRT2 mRNA在不同組織中的表達水平進行相對定量。

在蘇姜豬母豬14個組織中均檢測到SIRT2 mRNA的表達，由圖1可知，SIRT2 mRNA在心臟組織中的表達量相對最高，顯著高于其他組織（P<0.05）;在肝臟、背最長肌、腿肌中的表達量均較豐富，顯著高于除腹脂和肺組織外的其他組織（P<0.05）;在脾、卵巢、輸卵管、子宮組織中的表達量相對最低。

2.2 蘇姜豬組織中SIRT2表達定位分析

通過免疫組化檢測，在蘇姜豬的心臟、肝臟、脾、肺、腎臟、胃、大腸、小腸、皮下脂肪、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮共14個組織樣中均檢測到SIRT2免疫陽性細胞（圖2）。

通過免疫組化檢測，SIRT2免疫陽性顆粒主要分布在蘇姜豬心臟、背最長肌和腿肌的肌肉組織的肌細胞質(zhì)中。其他組織中，SIRT2免疫陽性細胞除分布于相應肌層外，還主要分布于胃組織黏膜層的固有腺層，小腸、大腸、輸卵管、子宮組織的黏膜層，肝臟組織的肝小葉，腎臟組織的近曲小管和遠曲小管，肺組織的肺泡上皮層和支氣管的黏膜層，脾臟組織的紅髓，卵巢組織的皮質(zhì)部和卵泡的顆粒層，皮下脂肪的脂肪細胞中，且均主要分布于各組織細胞的細胞質(zhì)中。

3 討論與結(jié)論

SIRT2作為第3類去乙?；窼irtuins家族中的一員，是一種保守的NAD（nicotinamide adenine dinucleotide，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）依賴性去乙酰酶沉默信息調(diào)節(jié)因子，在細胞周期、脂肪細胞分化、細胞骨架形成、神經(jīng)系統(tǒng)功能、衰老、氧化應激和熱量限制等生命過程中具有重要的調(diào)控作用[2]。在不同組織中，作為去乙酰化酶的SIRT2能與許多不同的因子結(jié)合使其去乙?；?，如Histone、Tubulin、Foxo1、p53、p300、CDC14B等因子，然而，SIRT2也存在被其他因子乙酰化，減弱其乙?；钚缘那闆r，因此SIRT2在不同組織和生物反應過程中發(fā)揮著多樣的作用[4]。豬SIRT2位于第6條染色體，由9個外顯子和8個內(nèi)含子組成。本研究通過實時熒光定量檢測方法，在所采集的蘇姜豬14個組織樣中均檢測到SIRT2基因mRNA的表達，這與Jin 等[5]和劉炳婷[2]在豬的許多組織中檢測到SIRT2 mRNA的表達報道相同，表明SIRT2在蘇姜豬組織中的表達也具有廣泛性。

對比各組織器官中SIRT2 mRNA的表達量差異，在熱量限制的小鼠模型中，發(fā)現(xiàn)大量SIRT2 mRNA存在于白色脂肪組織和腎臟組織中[6]。吳國芳等在小鼠肌肉和心臟組織中檢測到SIRT2 mRNA相對高的表達量，肝、肺、腎、脂肪中呈中等表達，脾組織中的表達最低[7]。桂林生在秦川牛的腎臟、皮下脂肪組織和肺臟中檢測到SIRT2 mRNA呈現(xiàn)高度表達，而在肌肉、心臟和肝臟中呈現(xiàn)低度表達[8]。劉炳婷在長白豬的肌肉和脂肪組織中檢測到較豐富的SIRT2 mRNA表達[2]。本研究在蘇姜豬心臟、肌肉和肝臟組織中檢測到豐富的SIRT2 mRNA表達，其次為脂肪組織，脾組織中則表達量相對較低，這一表達量差異趨勢與吳國芳等的報道相似。蘇姜豬肌肉和脂肪組織中豐富的SIRT2 mRNA表達，表明SIRT2基因與蘇姜豬的生長發(fā)育和肉質(zhì)性狀間存在直接或間接的關(guān)系。

通過定位檢測，發(fā)現(xiàn)SIRT2主要位于細胞質(zhì)中，與微管共定位，為α-微管蛋白的去乙?；?，并在少突膠質(zhì)細胞的分化過程中起著重要的作用[9]，此外，SIRT2還可通過使p65去乙?；?，以調(diào)節(jié)NF-κB依賴性基因的表達。而在細胞有絲分裂的G2/M轉(zhuǎn)換期，SIRT2可以瞬間轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，去乙?；M蛋白H4的16位賴氨酸，降低其乙?；?，推遲細胞從分裂期退出[10-12]。本研究通過免疫組織化學檢測蘇姜豬各組織中SIRT2表達分布，結(jié)果與相關(guān)報道相同，SIRT2免疫陽性顆粒主要定位于各組織細胞的細胞質(zhì)中。Yang等證實SIRT2能夠通過Nrf2信號通路參與心力衰竭[13]，本研究在蘇姜豬心臟和肌肉組織中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒，且在

實時熒光定量檢測中測得相對較高的SIRT2 mRNA表達量，表明SIRT2對于蘇姜豬心臟及肌肉功能的重要性。除肌細胞外，SIRT2免疫陽性細胞還主要分布于蘇姜豬消化系統(tǒng)如胃、小腸、大腸的腺體層和消化腺——肝臟的肝小葉中，表明SIRT2與腺細胞的分泌功能有關(guān)。

肺是動物的呼吸器官，具有呼吸、代謝、防御功能。通過免疫組織化學檢測方法，在蘇姜豬肺組織的支氣管的上皮層和肺泡上皮細胞的細胞質(zhì)中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒。細支氣管的上皮層由纖毛細胞和分泌細胞組成;肺泡上皮主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡細胞組成，其中Ⅱ型肺泡細胞相對最多，具有合成與分泌表面活性物質(zhì)，降低肺泡的表面張力，使肺泡回縮力降低，穩(wěn)定肺泡的形態(tài)，以減少吸氣阻力的作用。蘇姜豬肺支氣管上皮層和肺泡上皮細胞中SIRT2的表達可能與上述細胞的分泌功能有關(guān)。

Jin等在豬睪丸中檢測到SIRT2 mRNA的高表達[5]，但有關(guān)SIRT2 mRNA在雌性動物生殖系統(tǒng)中的表達量情況則鮮見報道。本研究在蘇姜母豬的生殖系統(tǒng)中，檢測到SIRT2 mRNA的表達，但表達量不高。經(jīng)免疫組織化學檢測，SIRT2免疫陽性細胞主要分布于卵巢組織的皮質(zhì)部和卵泡的顆粒層，輸卵管和子宮組織的黏膜層，表明SIRT2可能參與卵泡的形成及卵母細胞的成熟過程，并且與生殖道中細胞的分泌功能有關(guān)，但在發(fā)情周期不同階段，SIRT2的表達是否存在規(guī)律性變化，有待后續(xù)進一步研究。

腎臟具有動物機體排泄體內(nèi)代謝廢物，以維持體內(nèi)鈉、鉀、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定及酸堿平衡的功能[14]。其中，近曲小管的功能主要是重吸收功能，而遠曲小管的功能則是繼續(xù)吸收水和鈉離子，并向管腔內(nèi)分泌鉀離子、氫離子和氨，這對維持血液的酸堿平衡有重要作用。本研究在蘇姜豬腎臟組織的近曲小管和遠曲小管的上皮細胞中檢測到豐富的SIRT2免疫陽性顆粒，表明SIRT2與近曲小管和遠曲小管上皮細胞的吸收和分泌功能有關(guān)。

脂肪組織是動物重要的代謝器官和內(nèi)分泌器官，調(diào)控著動物機體許多生理和病理過程。在Situins家族的所有蛋白中，SIRT2被認為是在脂肪組織中表達量最高的蛋白[15-16]。在小鼠3T3-L1脂肪細胞和豬前體脂肪細胞中，SIRT2基因超表達可通過去乙?；疐oxO1，促進FoxO1與PPARγ的結(jié)合，抑制PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性，進而抑制脂肪細胞的分化。在動物機體因為饑餓或者能量消耗需要脂類水解供能時，SIRT2通過對FoxO1的去乙?；{(diào)控脂類的水解[17]。本研究在蘇姜豬皮下脂肪的脂肪細胞中檢測到SIRT2免疫陽性顆粒，且SIRT2 mRNA表達量較豐富，表明SIRT2基因與蘇姜豬脂肪組織形成有關(guān)。