陳家煒，梁 華，李文倩，張 瑩，胡瑜輝，柴 智，趙建平，梁建萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)黃芪資源產(chǎn)業(yè)化及產(chǎn)業(yè)國際化協(xié)同創(chuàng)新中心，山西晉中030619）

黃芪為豆科植物蒙古黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.Var.mongholicus（BSe.）Hsiao）或膜莢黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.）的干燥根，其主要藥效成分為黃酮、皂苷和多糖等[1]，具有補氣固表、脫毒排膿、生肌等功效[2]。因黃芪藥材需求量的不斷增加，野生資源已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求，市場黃芪主要來自人工種植。就山西省而言，2015 年統(tǒng)計，黃芪人工種植面積約1.33 萬hm2，傳統(tǒng)鮮芪總產(chǎn)1 500 t，實現(xiàn)產(chǎn)值近5 000 萬元[3-4]。但是，大量的市場需求和粗放的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了市場上黃芪有效成分差異較大，產(chǎn)品質(zhì)量無法保證。

誘導(dǎo)子是一類能通過選擇性誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，進(jìn)而活化特定次生代謝途徑、提高植物次生代謝物含量的物質(zhì)[5]。前期試驗表明，15 μmol/L SA、15 mmol/L SNP、1.0 mg/L NAA 可以顯著促進(jìn)黃芪有效成分的積累，且SA 對黃酮效果最明顯[6]。此外，從黃芪體內(nèi)分離得到的固氮菌T16 和T21 可以有效促進(jìn)黃芪幼苗的生長[7]。綠肥是一種可再生資源[8]，可以為植物提供全面的營養(yǎng)，特別是增加土壤氮、磷、鉀含量，進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[9-10]。大量研究已經(jīng)證明，合理施肥可以有效提高黃芪品質(zhì)[11-13]，但是從分子水平解釋施肥對黃芪有效成分積累影響的研究鮮有報道。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是連接初級代謝和苯丙烷類代謝、催化苯丙烷類代謝第1 步反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶[14]，影響黃酮類化合物的生物合成[15]。查爾酮合酶（CHS）是黃酮化合物合成代謝途徑中的第1 個限速酶[16]，它催化該途徑的第1 步，即將小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化形成一個具有C15 架的黃酮類化合物查爾酮。該產(chǎn)物進(jìn)一步衍生轉(zhuǎn)化構(gòu)成了各類黃酮化合物[15]。鯊烯合酶（SS）是三萜皂苷生物合成途徑中第1 步，是催化法呢酯焦磷酸（FPP）縮合產(chǎn)生鯊烯（SQ）的關(guān)鍵酶[17]。大量研究表明，植物黃酮類化合物的累積與PAL、CHS 基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，而SS 基因在植物皂苷類物質(zhì)合成途徑中起著極其重要的作用[18-23]。

本研究利用實時熒光定量PCR，從mRNA 轉(zhuǎn)錄水平定量檢測PAL、CHS 和SS 這3 個基因在不同肥料（誘導(dǎo)子SA、SNP、NAA，固氮菌T16、T21，黃芪莖葉綠肥）配比處理下，黃芪根莖部位中的表達(dá)差異，從分子水平探討不同肥料配比對黃芪有效成分合成積累的影響，旨在為黃芪人工栽培合理的水肥管理提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用黃芪種子采自山西大同渾源黃芪藥材基地。所用水楊酸（SA）、萘乙酸（NAA）和硝普鈉（SNP）分別購自天津北辰方正、天大、天力化學(xué)試劑廠；固氮菌T16、T21 母液為前期試驗獲得；黃芪莖葉綠肥采自山西省大同市渾源縣種植基地。

1.2 試驗設(shè)計

黃芪種子先用H2SO4浸泡4 min，再用自來水沖洗，直至干凈，輕微晾干后，分別用15 μmol/L 的SA、15 mmol/L 的SNP 和1.0 mg/L 的NAA 進(jìn)行浸種處理。

表1 試驗因素水平

2016 年4 月中旬整地、分區(qū)、施肥及人工播種。小區(qū)樣地5 m×3 m，株距15 cm，行距25 cm，每小區(qū)需60 g 黃芪種子。采用4 因素3 水平正交試驗設(shè)計，A 因素為誘導(dǎo)子的種類、B 因素為綠肥用量、C 因素為固氮菌T16 濃度、D 因素為固氮菌T21 濃度，因素水平列于表1，處理方案列于表2。

表2 處理方案

1.3 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

使用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的通用植物RNA 提取試劑盒（離心柱型）分別對樣本的根、莖總RNA 進(jìn)行提取。利用微量分光光度計檢測RNA 的純度，并通過瓊脂凝膠電泳檢測RNA 的完整性后，使用TAKARA BIO INC RR047A 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將反應(yīng)體系5×gDNAEraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，Total RNA 6 μL，RNase Free dH2O 1 μL 在42 ℃下反應(yīng)2 min 之后，迅速放在冰浴上；在原體系基礎(chǔ)上，加入PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4 μL，RNase Free dH2O 4 μL，并于37 ℃下反應(yīng)15 min，再于85 ℃下反應(yīng)5 s，之后冷卻至4 ℃；用微量分光光度計檢測cDNA 濃度后，用ddH2O 稀釋至100 ng/μL，并于-20 ℃保存。

1.4 普通PCR

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行梯度PCR，篩選引物和模板的最佳退火溫度。在最佳退火溫度下進(jìn)行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。反應(yīng)體系為：10 μL 2×Master-Mix、0.5 μL 上游引物、0.5 μL 下游引物、1 μL 模板、8 μL ddH2O，共20 μL。

1.5 實時熒光定量PCR

采用TaKaRa 公司SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）試劑盒，根據(jù)說明書建立20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ5 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，上下游引物混合共0.8 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL。每個樣品重復(fù)檢測3 次。PCR 反應(yīng)采用2 步法，程序為：95 ℃初始變性10 min；95 ℃變性15 s，Tm ℃退火延伸1 min，重復(fù)40 個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行65～95 ℃的融解曲線分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA 提取

凝膠電泳圖片顯示（圖1），提取RNA 條帶清晰，結(jié)構(gòu)完整，無拖尾現(xiàn)象；微量分光光度計檢測OD260/OD280值，在1.8～2.0，表明無降解、無污染、純度高。以上2 項檢測說明提取的RNA 質(zhì)量較高，可以使用。

2.2 引物及退火溫度篩選

采用普通PCR 和熒光定量PCR 共同篩選引物。其中，普通PCR 儀設(shè)置退火溫度梯度，反應(yīng)完成，用瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物質(zhì)量，初步篩選出目的條帶較亮且引物二聚體較少的引物序列及合適的退火溫度，再用熒光定量PCR 進(jìn)一步篩選及檢測。引物設(shè)計如表3 所示。

表3 引物序列

退火溫度梯度設(shè)計為53.0，53.5，54.3，55.7，57.3，58.6，59.5，60.0 ℃，最終篩選出來的退火溫度為57 ℃。

2.3 不同肥料配比對PAL 基因表達(dá)的影響

不同肥料處理后PAL 基因在黃芪根部的表達(dá)量不同（圖2），處理6 和處理9 與對照相比顯著提高，相對表達(dá)量分別是對照的2.1 倍和1.6 倍；其他各組與對照相比都表現(xiàn)為下降，其中，處理2、處理5 和處理8 下降超過50%，處理3 和處理7 下降較少，不超過10%。

從PAL 基因在莖部的表達(dá)量來看（圖3），處理2、處理4 和處理6 相較于對照有所下降，其中，處理2 和處理6 下降較少，相對表達(dá)量分別下降6.05%和5.92%，處理4 下降最多，相對表達(dá)量下降了61.73%；其他各處理組合均高于空白對照，其中，處理1、處理5 明顯高于對照，分別為對照的5.73 倍和5.83 倍。

2.4 不同肥料配比對CHS 基因表達(dá)的影響

從CHS 基因在根部的表達(dá)量來看（圖4），處理4、處理6、處理7 以及處理9 均高于空白對照，其中，處理7 為對照的1.52 倍，處理6 最高，為對照的2.14 倍；其他處理組合均低于對照，其中，處理5、處理8 下降超過50%，相對表達(dá)量分別較對照下降64.07%和71.71%。

從CHS 基因在莖部的表達(dá)量來看（圖5），處理3、處理4 和處理6 相較于對照有所下降，其中，處理6 下降最多，相對表達(dá)量下降65.25%；處理2 與對照相比，變化不明顯；其他處理組合均比對照有明顯增長，處理1 增長最明顯，相對表達(dá)量為CK的7.19 倍，其余處理依次為處理5＞處理7＞處理9＞處理8。

2.5 不同肥料配比對SS 基因表達(dá)的影響

從SS 基因在根部的表達(dá)量來看（圖6），處理2、處理5、處理6 和處理8 相對表達(dá)量較對照有所下降，其中，處理2、處理6 下降小于10%，分別為4.02%和8.54%，處理5 下降最多，下降了47.13%；其余處理相對表達(dá)量較對照均有所增加，其中，處理3 增長最多，為對照的18.44 倍；其余處理相對表達(dá)量大小依次為處理1＞處理7＞處理4＞處理9，分別為對照的6.79 倍、2.04 倍、1.70 倍和1.51 倍。

從SS 在莖部的表達(dá)量來看（圖7），只有處理4和處理5 的相對表達(dá)量小于對照，其中，處理5 下降最明顯，用本試驗的檢測方法幾乎檢測不到；其他各處理的相對表達(dá)量較對照均有所提高，處理1增加最明顯，為對照的22.83 倍；處理2 和處理7 增長超過5 倍，分別為對照的6.06 倍、9.17 倍；其余處理依次為處理9＞處理8＞處理3＞處理6，分別為對照的2.76 倍、2.01 倍、1.85 倍和1.68 倍。

3 結(jié)論與討論

PAL、CHS、SS 都是黃芪有效成分合成與積累的關(guān)鍵酶，它們的表達(dá)量影響著黃芪的品質(zhì)及藥用價值。有研究表明，平衡合理施肥是促進(jìn)黃芪生長、增加產(chǎn)量及提高品質(zhì)的重要栽培手段[24-25]。本研究結(jié)果表明，施入不同配比的肥料后，上述3 個基因的表達(dá)量與對照相比均有顯著性差異。

在3 種對黃芪種子進(jìn)行浸種處理的誘導(dǎo)子中，15 μmol/L 水楊酸對上述3 個基因在根、莖部位的表達(dá)量的影響最大。其中，水楊酸使黃酮合成關(guān)鍵酶基因PAL、CHS 在根部的相對表達(dá)量大幅減小，而莖部的相對表達(dá)量大幅增加，造成了這2 個基因在植物體不同部位的表達(dá)差異。杜研[26]、王景然等[27]研究表明，低濃度水楊酸能夠有效促進(jìn)黃芪愈傷組織和幼苗的總黃酮積累。結(jié)合本試驗結(jié)果和已有研究成果，推測低濃度水楊酸是通過影響黃芪黃酮合成途徑上關(guān)鍵基因在黃芪根、莖部位表達(dá)差異的方式而促進(jìn)黃芪總黃酮的積累，但其具體機制還有待更深入的研究。

本研究結(jié)果表明，施入不同配比的肥料對黃芪次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶基因PAL、CHS、SS 表達(dá)有明顯的影響，且在根、莖不同部位存在差異，這將會影響黃芪有效成分的合成與積累。至于這些基因如何調(diào)控黃芪有效成分的合成與積累，還有待于進(jìn)一步探討。