楊麗莉，楊 睿，常建忠，蔣 丹

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究中心，山西太原030031）

萱草（Hemerocallis hybrida）是百合科萱草屬多年生宿根植物，國內(nèi)本土大花萱草通常易感染銹病和炭疽病菌。國外引進的大花萱草新品種[1]特別易感染一種新型病菌——萱草葉枯?。↘abatiella microsticta）[2]，主要為害葉片，形成病斑，并不斷蔓延，尤其對紅運萱草的危害達到70%以上。針對萱草葉枯病的致病菌國內(nèi)外學(xué)者已找到了病菌敏感的殺菌劑[2-4]。但是，園林綠化大面積噴施殺菌劑勢必會對環(huán)境造成污染，同時加大了園林的管理難度。因此，最有效的方法是對其進行抗葉枯病性狀改良，提高其抗病性。

研究葉枯病菌毒素液對深入了解病原菌致病機制、利用毒素就寄主抗病性進行快速檢測、篩選抗病材料是十分重要的[5]。本試驗就萱草葉枯病菌毒素液對紅運萱草愈傷組織分化芽生長的影響和防御酶（SOD、POD、CAT）活性變化進行了研究，旨在為探索葉枯病發(fā)生機制和利用病菌毒素液進行抗病突變體篩選提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試萱草苗 從國外引進分株2～3 年生易感染葉枯病的品種紅運，在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗示范基地種植。

1.1.2 供試菌株 萱草葉枯病菌（Kabatiella microsticta Bubak（syn.Aureobasidium microstictum（Bubak）W.B.Cook）），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理教研室分離鑒定并保存。

1.1.3 保護酶測定試劑盒 采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒。SOD 試劑盒（測總），羥胺法（貨號為A001-1）；POD 試劑盒（植物，貨號為A084-3）；CAT 可見光試劑盒（貨號為A007-1）。

1.2 方法

1.2.1 葉枯病菌毒素培養(yǎng) 受體材料為大花萱草紅運的愈傷組織分化芽。紅運的組織培養(yǎng)為專利技術(shù)[6]。

1.2.2 葉枯病菌粗毒素液的制備和毒力檢測 其參照文獻[7]進行。

1.2.3 葉枯病菌粗毒素液培養(yǎng)試驗 受體為大花萱草紅運愈傷組織繼代培養(yǎng)分化出的1～2 cm 的分化芽。繼代培養(yǎng)基中分別添加濃度20%，40%，60%的病菌毒素液，分別標(biāo)記為1，2，3 號，同時以不添加毒素液為對照（CK），高壓滅菌后備用。選取大小基本一致的萱草分化芽，剪去上部葉片，每瓶8 株，每處理3 瓶，3 次重復(fù)。（25±1）℃，16 h 光/8 h暗，光照強度2 800 lx。觀察生長狀況。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生長量指標(biāo)的測定 分別在分化芽的第0，8，16，24，32 天稱其鮮質(zhì)量，繪制生長量曲線。調(diào)查成活數(shù)，計算存活率。

1.3.2 保護酶活性的測定 采用南京建成生物工程研究所試劑盒法測定保護酶活性。在處理前和處理后第2，7，14，21 天分別進行保護酶活性的測定。保護酶提取液制備和測定均按試劑盒標(biāo)準(zhǔn)進行。以雙蒸水為對照，3 次重復(fù)。分別計算總SOD、POD 和CAT 酶活力。

式中，總SOD 酶活性為每克組織在1 mL 反應(yīng)液中SOD 抑制率達50%時所對應(yīng)的SOD 量為一個SOD 活力單位（U）（U/g）；Ack為對照OD 值；AE為樣品OD 值；V 為反應(yīng)液總體積（mL）；Vt為取樣量（mL）；N 為勻漿液濃度（組織鮮質(zhì)量（g）/勻漿介質(zhì)體積（mL），按1%計）。

式中，POD 酶活性為37 ℃下，每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg 底物的酶量定義為一個酶活力單位（U/mg）；Ack為對照OD 值；AE為樣品OD 值；B 為比色光徑（1 cm）；V 為反應(yīng)液總體積（mL）；Vt為取樣量（mL）；T 為 反應(yīng)時間30 s；M 為勻漿蛋白濃度（mg/mL），以1.0 mg/mL 計算。

式中，CAT 酶活性為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位（U/mg）；271 為斜率的倒數(shù)；Ack為對照OD 值；AE為樣品OD 值；Vt為取樣量（mL）；M 為勻漿蛋白濃度，以1.0 mg/mL計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007 進行，單因素方差分析采用SPSS 軟件進行，采用LSD 法進行平均值間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉枯病菌粗毒素液對分化芽生長的影響

用添加不同濃度葉枯病菌粗毒素液的固體培養(yǎng)基對愈傷組織分化芽進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病菌毒素液對分化芽均有不同程度的毒害作用，主要表現(xiàn)在葉片出現(xiàn)水漬型黃化、生長緩慢和致死效應(yīng)，并隨著培養(yǎng)時間的延長毒害作用加劇。前3 d 各處理的毒害作用表現(xiàn)均不明顯；3 號樣品在7 d 左右時葉尖部開始發(fā)黃，并向下蔓延；2 號和1 號則出現(xiàn)在10～15 d；隨著培養(yǎng)時間的延長，3 號整株失綠，生長停滯，逐漸死亡；2 號和1 號的生長狀態(tài)與3 號相似，但是毒害作用較輕，受傷害程度大小依次為3 號＞2 號＞1 號（圖1）。

從表1 可以看出，隨著毒素液濃度的增加抑制作用增強。毒素液濃度在20%（1 號）時，分化芽生長勢比較旺盛；達到40%（2 號）時生長緩慢；達到60%（3 號）時，前16 d 時生長速度雖然不及1 號和2 號，但是還有緩慢生長，之后生長趨于停滯狀態(tài)。從不同處理增長量的方差分析結(jié)果可以看出，前8 d，1 號與CK 間沒有顯著差異，2 號和3 號與CK和1 號間在0.05 水平上差異顯著；到第32 天時，1、2、3 號和CK 之間在0.05 水平差異均顯著。說明病菌毒素液對分化芽生長的影響是非常巨大的，濃度達到60%時，分化芽生長極其緩慢，甚至停止生長。

表1 葉枯病菌粗毒素液對分化芽生長的影響 g

2.2 葉枯病菌粗毒素液對分化芽的致死作用

葉枯病菌粗毒素液對分化芽的生長產(chǎn)生很大的抑制和傷害作用，進一步影響到了成活率。從圖2 可以看出，毒素液對成活率的影響在前16 d 尚不明顯，16 d 后十分明顯。同一濃度下，隨著培養(yǎng)時間的延長，成活率有不同程度的下降。菌液濃度增加，分化芽成活率顯著下降，其中，菌液濃度在40%（2 號）、生長24 d 時，成活率下降到了50%；32 d時，降到40%左右。菌液濃度在60%（3 號）時，從16 d 起，成活率下降幅度明顯高于1，2 號，在32 d時成活率只有20%左右。說明20%濃度（1 號）的菌液對分化芽成活率的影響不明顯，40%濃度（2 號）時的死亡率達到40%～50%，60%濃度（3 號）有強致死效應(yīng)。結(jié)合分化芽的生長狀況分析得出，在培養(yǎng)基中添加病菌毒素液濃度為40%是一個篩選的合理劑量，培養(yǎng)時間為24 d 較適宜。

2.3 葉枯病菌粗毒素液對防御酶活性的影響

2.3.1 對SOD 酶活性的影響 SOD 催化O2-·歧化反應(yīng)生成O2和H2O2，其活性被認(rèn)為是抗逆境的重要指標(biāo)[8-9]。培養(yǎng)基中添加葉枯病菌粗毒素液對SOD酶活性均有不同程度的影響，導(dǎo)致分化芽SOD 酶活性呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，升高的幅度與毒素液濃度呈正相關(guān)（圖3）。SOD 酶活性在第2 天達到最高值；7 d 內(nèi)，3 號維持在最高水平，1，2 號緩慢下降，14 d 時下降到CK 水平；之后持續(xù)下降，在21 d時，SOD 酶活性達到最低，1，2，3 號均低于CK，其中，3 號最低，其次依次為2 號和1 號。說明分化芽接種到含病菌毒素液的培養(yǎng)基上，在毒素逆境條件作用下，分化芽細胞迅速啟動SOD 酶防御系統(tǒng)，酶活性迅速升高，清除O2-·自由基，并持續(xù)在較高水平。毒素液濃度越高，對細胞的毒害作用越強，酶活性升高的幅度越大。隨著逆境時間的延長，細胞受毒害作用持續(xù)增強，SOD 酶系統(tǒng)不足以清除植株中積累的大量超氧陰離子自由基，細胞逐漸衰老死亡，SOD 酶活性持續(xù)下降。在3 個處理中，1 號和2 號比3 號受傷害小。

2.3.2 對POD 酶活性的影響 POD 是植物體內(nèi)普遍存在的氧化還原酶，它不僅參與木質(zhì)素、酚類物質(zhì)及植保素的合成，還作為整個代謝途徑的調(diào)節(jié)子，是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧的清除劑，是公認(rèn)的與植物抗性相關(guān)的酶[9-10]。培養(yǎng)基中添加葉枯病菌粗毒素液分化芽POD 酶活性先升高后下降（圖4）。培養(yǎng)24 h，POD 酶活性略有升高，培養(yǎng)到第7 天病癥出現(xiàn)時，酶活性才迅速升高，升高的幅度與添加的毒素液濃度呈正相關(guān)，與接種大豆花葉病毒后的反應(yīng)相同[11]。隨著毒素液培養(yǎng)時間的延長，酶活性下降，下降的幅度與毒素液濃度呈負相關(guān)。在21 d時，3 號酶活性最高，與1，2 號和CK 間顯著差異。說明毒素濃度越高對植株的刺激作用越強，細胞以提高POD 酶活性來應(yīng)對逆境環(huán)境，可能是細胞的應(yīng)激反應(yīng)和防御機制[12]。

2.3.3 對CAT 酶活性的影響 CAT 存在于需氧的生物體內(nèi)，在消除過氧化物酶體中的H2O2時起到重要作用[13]。培養(yǎng)基中添加葉枯病菌粗毒素液分化芽CAT 酶活性先升高后下降，升高的幅度與毒素液濃度呈正相關(guān)（圖5）。CAT 酶活性在第2 天達到峰值，各處理之間、各處理與CK 之間均呈顯著差異。之后酶活性下降，在21 d 時接近CK 水平。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，葉枯病菌毒素液對大花萱草分化苗生長具有一定的毒害作用，使得植株生長量、存活率和保護酶活性等方面存在著明顯的劑量差異。病菌毒素液劑量低，毒害作用弱；劑量高，毒害作用強。這一結(jié)果對于室內(nèi)進行抗病資源的篩選與鑒定具有十分重要的參考價值[14]，20%～40%的劑量范圍是適合的篩選劑量。結(jié)合誘變育種進行抗病突變體選擇壓篩選，獲得抗病突變體材料，對大花萱草抗葉枯病育種具有十分重要的意義。

參與植物體內(nèi)多種生理代謝過程的SOD、POD和CAT 以及PAL 和PPO 等酶系與植物抗性密切相關(guān)[15]。其中，SOD 酶是植物與病原物識別過程中產(chǎn)生初始抗性信息的一個關(guān)鍵酶，其主要功能是通過歧化反應(yīng)清除超氧陰離子自由基，因此，SOD 常作為抗性機制起作用[16]；POD 酶屬于氧化酶系統(tǒng)，是細胞內(nèi)重要的內(nèi)源活性氧的清除劑。有研究發(fā)現(xiàn)，在病原菌染后，植物體內(nèi)細胞保護酶活性發(fā)生了相應(yīng)變化[11，17]。MONTALBINI 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接種煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）后，煙草葉片細胞SOD 酶活性明顯加強。朱友林等[19]在對玉米大斑病菌侵染玉米的研究中發(fā)現(xiàn)，抗病品種POD 基因等防衛(wèi)基因較感病品種更快速被誘導(dǎo)表達。吳岳軒等[20]研究發(fā)現(xiàn)，雜交稻感染白葉枯病菌后，葉片中POD 活性升高。本試驗中，萱草分化芽在經(jīng)不同濃度的粗毒素液培養(yǎng)后，3 種酶的活性都有不同程度的變化，呈現(xiàn)不同程度的先升高后降低，活性升高的程度與毒素液的濃度呈正相關(guān)，并顯示顯著差異，與接種病菌后的反應(yīng)是一致的。低濃度毒素液對分化芽的傷害作用較輕，濃度增加，傷害作用加劇。酶活性峰值出現(xiàn)的時間依防御酶的種類不同而不同。SOD 和CAT 酶活性峰值出現(xiàn)在第2 天，POD酶活性峰值出現(xiàn)在第7 天。因此，分化芽通過各級信號傳導(dǎo)激活防御酶系統(tǒng)，啟動與抗病性有關(guān)的基因得到表達，從而應(yīng)對病菌毒素液的傷害。這一結(jié)果為利用病菌毒素液作為選擇壓篩選抗病突變體提供了理論依據(jù)。