方新鑫， 孫明軍， 宮月華

中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.消化內(nèi)科； 2.腫瘤研究所暨普通外科研究所腫瘤病因與篩查研究室 遼寧省高校腫瘤病因與預防重點實驗室,遼寧 沈陽110001

胃癌作為一種常見的高發(fā)腫瘤，盡管多種治療手段都取得了巨大進步，但目前其依然是全球排名第五的腫瘤相關死亡原因[1]。繼續(xù)篩選胃癌診斷生物標志物、尋找胃癌治療可能的靶點非常重要。

近年來興起的非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)為此提供了新的視角。作為非編碼RNA中重要的一類，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)在疾病中的作用及功能已經(jīng)被廣泛認同[2-3]。例如，在一項關于適應性免疫的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)CD8(+)T細胞中表達了眾多的lncRNAs，通過進一步的功能分析提示這些lncRNAs在適應性免疫中發(fā)揮作用[4]。而在一項關于心肌梗死的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)lncRNA MALAT1通過miR-558調控ULK1依賴性自噬的發(fā)生，從而保護心肌細胞并改善心臟功能[5]。腫瘤相關的研究表明，lncRNA不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關，其作為生物標志物具有診斷及預后預測的作用。例如，linc-ZNF469-3在三陰性乳腺癌中促進肺轉移的發(fā)生，HOXD-AS1在多種腫瘤中通過不同的機制參與發(fā)生、發(fā)展的同時可以作為生物標志物進行診斷和預后預測[6-7]。TPT1-AS1是最近發(fā)現(xiàn)的位于13號染色體的lncRNA，目前僅在腦膠質瘤和宮頸癌中有2篇報道[8-9]。在腦膠質瘤中，研究者通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)TPT1-AS1在Ⅲ級腦膠質瘤中低風險組較高風險組低表達，TPT1-AS1表達水平隨著腫瘤分級的升高而降低，因而TPT1-AS1在腦膠質瘤中是一個保護性基因[8]。而在宮頸癌的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)TPT1-AS1的表達水平較鄰近正常組織升高，其表達水平與惡性相關的臨床病理特征也相關，如更高的國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期、更大的腫瘤直徑、更多的遠處淋巴結轉移等[9]。然而，TPT1-AS1在胃癌發(fā)生過程中的變化趨勢、表達水平與胃癌臨床病理特征的相關性尚不明確。

本研究利用胃癌患者的腫瘤組織及遠端基本正常組織標本，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法檢測TPT1-AS1的表達水平，旨在明確TPT1-AS1在胃癌及遠端基本正常組織中的差異表達，探討其表達水平與胃癌臨床病理特征的相關性，評價其作為胃癌生物標志物的可能性。本研究對于進一步了解TPT1-AS1在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及為胃癌的早診早治提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 組織標本來源及存儲本實驗共納入胃癌患者標本76例，其中遠端基本正常組織66例，胃癌(gastric cancer, GC)73例，男52例，女24例，平均年齡60.41歲。所有納入研究的胃癌患者在接受外科手術前均未接受其他腫瘤相關手段的治療。組織標本在外科手術切除后快速取材放置于RNA later(Thermo Fisher，維爾紐斯，立陶宛)(組織體積的5倍)中，液氮中短暫保存后移至-80 ℃冰箱中長期保存，取材及標本編號人員不參與后續(xù)實驗。本實驗經(jīng)中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

胃癌患者的最終診斷及臨床病理特征由2位病理學專家分別獨立進行判定。腫瘤分期TNM依據(jù)AJCC第八版[10]，組織學分類以WHO 2010版[11]為依據(jù)。幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染的診斷采用酶聯(lián)免疫吸附法(BIOHIT OYJ，赫爾辛基，芬蘭)。采用電話隨訪患者至2018年3月，其中58例納入預后分析(平均生存時間23.93個月，隨訪時間4～52個月，死亡18例)，其余15例因隨訪失敗未納入。本研究將總生存期(overall survival, OS)定義為從手術時間到死亡時間。

1.2 總RNA提取及逆轉錄聚合酶鏈反應采用RNAiso Plus(Takara，北京，中國)進行總RNA提取。RNA濃度通過NanoDrop ND-1000測定， OD260/OD280值在1.8～2.1為純度合格?？俢DNA反轉，采用每10 μl 體積加入500 ng RNA及2 μl PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara，北京，中國)，RNase-free ddH2O配平體系后按照說明書條件進行逆轉錄聚合酶鏈式反應。獲得的cDNA測定濃度后用RNase-free ddH2O稀釋為200 ng/μl，分裝后放置于-20 ℃短期保存，-80 ℃長期保存。所有實驗均在冰上操作。

1.3 qRT-PCR采用ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀進行該部分實驗。每20 μl反應體系內(nèi)加入400 ng cDNA、10 μl TB Green series(TaKaRa，北京，中國)、正反鏈引物各0.6 μl及6.8 μl RNase-free ddH2O。qRT-PCR實驗條件為95 ℃ 15 min預變性，95 ℃ 10 s、56 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s重復40個循環(huán)。所有實驗引物均由Primer Blast網(wǎng)站設計，TPT1-AS1的正義鏈引物序列為5′-GCTATCCTTGCCCATCTTCCTAAA-3′，反義鏈引物序列為5′-GAGGCCAGTGCTCTGAAGGAAA-3′。β-actin的正義鏈引物序列為5′-ATGTGGCCGAGGACTTTGATT-3′，反義鏈引物序列為5′-AGTGGGGTGGCTTTTAGGATG-3′。qRT-PCR反應特異性由熔解曲線判斷，若呈單峰則特異。

1.4 統(tǒng)計學分析采用SPSS 18.0版本及 GraphPad Prism 5.0版本進行統(tǒng)計學分析和繪制圖形。對胃癌及遠端基本正常組間年齡、性別差異采用雙側χ2檢驗進行分析，采用獨立樣本t檢驗分析TPT1-AS1表達水平在兩組間的表達差異及與患者臨床病理特征的相關性。構建受試者工作曲線(receiver operator characteristic, ROC)評價TPT1-AS1作為胃癌診斷生物標志物的效率。采用Kaplan-Meier analysis進行生存分析以判斷TPT1-AS1作為胃癌預后生物標志物的可能性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在胃癌組織中TPT1-AS1的表達水平降低本研究共納入73例胃癌組織標本，男49例，女24例，≥60歲43例，<60歲30例；納入遠端基本正常組織標本66例，男43例，女23例，≥60歲38例，<60歲28例。胃癌組與遠端基本正常組，年齡和性別比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.847、0.806)。

我們通過qRT-PCR方法分別檢測胃癌組及遠端基本正常組中TPT1-AS1的表達水平，采用△CT法計算其相對表達量，如圖1所示，在胃癌組織中TPT1-AS1的表達水平較遠端基本正常組織降低，差異有統(tǒng)計學意義(9.15±1.87vs7.83±1.71，P=0.004)。

圖1 TPT1-AS1在遠端基本正常組織及胃癌組織中的表達 Fig 1 Expression of TPT1-AS1 in distal normal tissue and gastric cancer tissue

2.2 TPT1-AS1表達水平與胃癌臨床病理特征無關

TPT1-AS1在胃癌組織中的表達水平與患者臨床病理特征，如性別、年齡、腫瘤直徑、H.pylori感染、腫瘤生長方式、腫瘤部位、TNM分期、Bormann分型、Lauren分型等均無相關性(P>0.05)(見表1)。

表1 TPT1-AS1表達水平與胃癌臨床病理參數(shù)的相關性Tab 1 Correlation between expression of TPT1-AS1 and

續(xù)表1

分類例數(shù)均數(shù)標準差P值 T14 8.27 2.12 T27 9.10 1.69 T3 9 9.97 1.89 T453 9.08 1.87 N期0.591 N025 9.07 1.73 N18 8.37 2.27 N2159.44 1.96 N3 25 9.30 1.86

注：*：64例患者行H.pylori感染檢查。△:有3例患者為神經(jīng)內(nèi)分泌癌或非霍奇金惡性淋巴瘤。

2.3 TPT1-AS1可以作為胃癌診斷的生物標志物采用ROC曲線對TPT1-AS1用于胃癌診斷的效能進行評價(見圖 2)。ROC曲線下面積(area under curve, AUC)為0.641(P=0.004)。其中，當截斷值(cut-off)為8.28時，TPT1-AS1診斷胃癌的敏感度及特異性分別為72.6%、51.5%。一致率、Youden指數(shù)、陽性似然比、陰性似然比分別為62.6%、24.1%、1.497、0.532。陽性預測值和陰性預測值分別為63.4%、63.0%。TPT1-AS1可以作為胃癌診斷的生物標志物。

圖2 TPT1-AS1表達水平診斷胃癌的ROC曲線 Fig 2 The ROC curve of diagnosis of gastric cancer with TPT1-AS1 expression

2.4 TPT1-AS1不能作為預測胃癌預后的生物標志物在完成隨訪的58例胃癌患者中，以TPT1-AS1表達水平(△CT)的均數(shù)(mean)為截斷值，高于9.246者為低表達組(25例)，低于9.246者為高表達組(33例)。TPT1-AS1高表達患者預后優(yōu)于低表達患者，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.605)(見圖3)。TPT1-AS1不能作為胃癌預后預測的生物標志物。

3 討論

lncRNAs作為ncRNAs中重要的一類，在人體正常生理及疾病發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[12-13]。本研究利用人胃新鮮組織標本，探討了反義lncRNA TPT1-AS1在胃癌組織和遠端基本正常組織中的差異表達情況，分析其表達水平與胃癌患者臨床病理特征的相關性，并評估其作為胃癌診斷及預后預測生物標志物的可能性。本研究對于揭示TPT1-AS1在胃癌發(fā)生中的作用及為胃癌的早診早治提供新的線索和依據(jù)。

圖3 TPT1-AS1表達水平與胃癌患者預后的相關性 Fig 3 Relationship between expression of TPT1-AS1 and prognosis of gastric cancer patients

TPT1-AS1在腦膠質瘤中首先被報道，研究者比較Ⅲ級腦膠質瘤低風險組與高風險組中TPT1-AS1的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)TPT1-AS1在低風險組高表達[8]。在宮頸癌的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中TPT1-AS1表達水平高于正常組織[9]。上述研究報道提示，TPT1-AS1在腦膠質瘤中可能發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用，而在宮頸癌中發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生的作用。但目前尚無TPT1-AS1在胃癌中的研究報道。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，TPT1-AS1在胃癌組織中較遠端基本正常組織呈現(xiàn)低表達，這表明TPT1-AS1在胃癌發(fā)生中可能是一個抑癌基因。關于TPT1-AS1在腫瘤發(fā)生中的分子機制，目前有研究通過細胞實驗證實TPT1-AS1靶向調控miR-324-5p促進宮頸癌細胞的增殖、侵襲、遷移及上皮間質轉化過程[9]，但是關于TPT1-AS1抑制胃癌發(fā)生的分子機制有待于進一步深入研究。我們進一步通過ROC曲線的分析，結果顯示TPT1-AS1作為胃癌診斷生物標志物時，其曲線下面積、靈敏度及特異性分別為0.641、72.6%及51.5%。我們的研究結果提示TPT1-AS1可能與胃癌的發(fā)生過程相關，且具有作為胃癌診斷生物標志物的潛能，這為胃癌的早診早治提供了新的線索。

此外，我們還分析了TPT1-AS1與胃癌患者臨床病理特征的相關性。研究結果顯示，TPT1-AS1表達水平與胃癌患者的臨床病理特征無關，如性別、年齡、腫瘤直徑、H.pylori感染、腫瘤生長方式、腫瘤部位、TNM分期、Lauren分型等。而目前在宮頸癌的研究中報道，TPT1-AS1表達水平在遠處淋巴結轉移病例中高于無淋巴結轉移的患者，在FIGO Ⅱ期病例中高于Ⅰ期病例[9]。在TPT1-AS1與胃癌患者預后相關性方面，本研究發(fā)現(xiàn)TPT1-AS1高表達的胃癌患者總生存期長于低表達組，但差異無統(tǒng)計學意義。而在膠質瘤的研究中，作者認為其可以作為獨立的觀察指標對患者的預后進行預測[8]。在宮頸癌的研究中，作者認為TPT1-AS1高表達組患者的總生存期顯著低于低表達組，高表達TPT1-AS1與不良的預后相關[9]。產(chǎn)生上述不一致結果的原因，一方面可能由于不同組織器官的差異，另一方面也可能由于樣本例數(shù)及隨訪時間的限制。隨著未來相關研究病例數(shù)的擴大及隨訪時間的延長，TPT1-AS1表達水平與胃癌患者總生存期的相關性可能會出現(xiàn)，但目前的研究結果仍然提示TPT1-AS1與胃癌的預后無關。

總之，我們的研究首次在胃癌組織中檢測TPT1-AS1的表達水平，并對其作為胃癌生物標志物的價值進行評價。研究結果表明，TPT1-AS1具有作為胃癌診斷生物標志物的可能性，然而其相關機制尚有待于今后繼續(xù)深入研究。