施 炎，李 新，陳楊武，王 臣，譚周亮

(1.綿陽師范學(xué)院資源環(huán)境工程學(xué)院，四川 綿陽 621006；2.中國科學(xué)院環(huán)境與應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041； 3.中國科學(xué)院成都生物研究所 環(huán)境微生物四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

1 前 言

表面活性劑作為洗滌劑中的主要活性成分，由最初的洗衣劑延伸運(yùn)用至乳化劑、潤滑劑、防腐劑等各行業(yè)，其中非離子表面活性劑是其最主要的組成部分[1～5]。非離子表面活性劑(R-O-(CH2CH2O)n-H)具有乳化、起泡、潤濕、滲透等特性[6-7]，主要分為聚氧乙烯醚類、多元醇酯類、酰胺類以及嵌段聚醚類4種類型[8]，聚氧乙烯(23)月桂醚(Brij-35)屬于聚氧乙烯醚類非離子表面活性劑。該類廢水直接進(jìn)入水體，即使在低濃度(1 mg/L)下也會(huì)產(chǎn)生大量持久性泡沫，這些大量不易消失的泡沫在水面形成隔離層，減弱了水體與大氣之間的氣體交換，致使水體發(fā)臭，且具有生物毒性并直接威脅到水生動(dòng)植物的生存[9-10]。

生物降解法因成本低且無二次污染而廣泛運(yùn)用于非離子表面活性劑污染的治理[11-12]。目前，國內(nèi)外已篩選出多株非離子表面活性劑降解菌株，主要包括假單胞菌(Pseudomonas)[13～15]、紅球菌(Rhodococcus)[16]、產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)和腸桿菌(Enterobacter)[17]等。這些菌株在25～30℃下表現(xiàn)出了較高的底物降解活性。然而，溫度是影響微生物生長與降解效果的關(guān)鍵因素之一[18-19]。研究表明，在35℃以內(nèi)，溫度每下降10℃微生物的降解活性與生長速率均減少一半[20-21]。Danie[22]等人的研究發(fā)現(xiàn)，溫度的降低對(duì)微生物的活性產(chǎn)生抑制作用，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪醇表面活性降解效果的下降。李亞選[23]等從東北地區(qū)活性污泥中篩選出混合菌株，通過與常溫菌株進(jìn)行低溫處理效果比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其所篩選的菌株在低溫環(huán)境下其降解效率比常溫菌高。由此可知，低溫高效降解菌株的獲得是解決此類污染物低溫處理的有效途徑之一。

本研究中，經(jīng)過長期低溫(10℃)馴化培養(yǎng)與純化分離，獲得一株Brij-35降解菌株，并對(duì)其進(jìn)行了16S rDNA鑒定。在此基礎(chǔ)上，研究了該菌株在不同pH、底物濃度下的降解特(性與反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，并考察了該菌株對(duì)聚氧乙烯(4)月桂醚(Brij-30)的降解情況，以期為聚氧乙烯醚類非離子表面活性劑廢水低溫生物處理的實(shí)際應(yīng)用提供菌種資源。

2 材料與方法

2.1 藥品與培養(yǎng)基

Brij-35與Brij-30均購于上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司；其余所用藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，(NH4)2SO40.3g/L，微量元素5 mL/L[24](pH 8.0)；篩選培養(yǎng)基由無機(jī)鹽培養(yǎng)基與Brij-35(0.25 ～1.0 g/L)構(gòu)成；固體培養(yǎng)基則是在培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂粉；LB培養(yǎng)基[25]：蛋白胨 10 g/L、酵母提取物 5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。

2.2 Brij-35低溫降解菌株的分離與形態(tài)觀察

用于菌株篩選的活性污泥取自四川省綿陽市某市政污水處理廠曝氣處理單元。接種活性污泥樣品20 mL于含500 mg/L Brij-35的三角瓶中，置于10℃、160 rpm恒溫振蕩器中長期馴化培養(yǎng)。當(dāng)Brij-35的去除率在24 h時(shí)超過90%時(shí)，接種活性污泥樣品1 mL進(jìn)行梯度稀釋與平板涂布，并置于恒溫培養(yǎng)箱(10℃)培養(yǎng)48～72 h。待平板上長出菌落后，挑取單菌落進(jìn)行再次劃線分離，如此反復(fù)4～5次后挑取單菌落接至LB液體培養(yǎng)基中10℃培養(yǎng)。將LB培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物按5%(v/v)的接種量轉(zhuǎn)接至Brij-35液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，篩選Brij-35降解速率最快的菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行革蘭氏染色，并利用電鏡掃描觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.3 Brij-35低溫降解菌株的鑒定

挑取單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，10℃條件下培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后，5 000 rpm離心后收集菌體。按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟進(jìn)行DNA提取。采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)與1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)對(duì)提取到的DNA樣品做PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：ddH2O 22μL ，PCR Maste Mix 25μL，27F和1942R各1μL，DNA樣品1μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5min；變性95℃ 30s，退火56℃ 30s，延伸72℃ 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、純化后送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。將測(cè)序結(jié)果在NCBI基因文庫進(jìn)行BLAST比較，并采用軟件MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.4 Brij-35低溫降解菌株的降解性能研究

按20%(v/v)的接種量將上述篩選到的Brij-35低溫降解菌株接入200 mL培養(yǎng)基(Brij-35濃度0.25 g/L)中，置于恒溫振蕩器(10℃、160 rpm)中培養(yǎng)24 h，制成種子液備用?？疾?0℃條件下菌株在不同pH(6～10)、底物濃度(100～1 000 mg/L)下的生長狀況、降解效果與反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究，從而獲得菌株的最適生長條件，并考察適條件下Brij-35低溫降解菌株的生長與降解效果。檢測(cè)指標(biāo)包括OD600、Brij-35與化學(xué)需氧量(COD)去除率。

2.5 Brij-35低溫降解菌株對(duì)Brij-30的降解效果考察

進(jìn)一步考察Brij-35低溫降解菌株對(duì)同類非離子表面活性劑聚氧乙烯醚Brij-30的降解效果。溫度設(shè)置為10℃，Brij-30的初始濃度設(shè)置為250 mg/L，其余條件同1.4。

2.6 分析方法與數(shù)據(jù)處理

化學(xué)需氧量(COD)采用微波消解法，菌體生長狀況采用600nm處的分光光度法。Brij-35測(cè)定參考KI-I2分光光度法[26-27]并稍作修改，簡(jiǎn)言之：向樣品中加入200 μL 1∶5 HCl溶液,使用純水定容至10mL，加入250 μL KI-I2顯色劑，搖勻并靜置反應(yīng)120 min，于500 nm 處測(cè)定吸光度。

Brij-35降解按一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行線性擬合[28-29]，公式如下：

lnc=-Kdt+lnC0

COD，Brij-35的去除率計(jì)算公式如下：

式中：c為基質(zhì)濃度，mg/L ；Kd為一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)，h-1；t為降解時(shí)間，h；C0為初始基質(zhì)濃度，mg/L。

3 結(jié)果與討論

3.1 降解菌株的形態(tài)觀察與鑒定

通過反復(fù)分離、純化，篩選到一株Brij-35降解低溫菌株，命名為YX3。10℃下培養(yǎng)2～3 d，在固體培養(yǎng)基上可形成半透白色、圓形、邊緣光滑，中間凸起且表面濕潤的菌落；在液體培養(yǎng)基中則為白色渾濁液體。革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)菌株YX3為革蘭氏陰性菌(圖1A)。由掃描電鏡照片(圖1B)可知，菌株YX3菌體為短桿狀，尺寸為2.66 μm(957～621 nm)。

圖1 YX3菌的革蘭氏染色顯微鏡圖(A)與電鏡掃描照片(B)Fig.1 Gram staining microscopic image (A) of strain YX3 and scanning electron micrograph(B)

經(jīng)16S rDNA測(cè)序，獲得片段長度為1 403 bp。如圖2所示，該菌與Acinetobacter sp.有99%相似性，因此鑒定為不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactersp.)，GenBank登錄號(hào)為MK138620。Acinetobacter可降解多種有機(jī)污染物，包括苯酚[30]、鄰苯二甲酸酯[31-32]、石油烴[33-34]、雌二醇[35]等物質(zhì)，而針對(duì)Acinetobacter降解非離子表面活性劑的菌株報(bào)道較少。

圖2 基于16S rDNA基因序列關(guān)系的菌株YX3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain YX3 based on 16S rDNA gene sequences relationship

3.2 菌株YX3對(duì)Brij-35的降解

不同pH下菌株YX3的生長與Brij-35降解效果如圖3所示。由圖3A可知，在pH 7～10時(shí)，15 h后菌株YX3生長量(OD600)良好且在pH 9生長最佳，而pH 6時(shí)生長情況不佳。由圖3B可知，菌株在pH 8～9的條件下均有較好的Brij-35降解效果，15 h去除率分別為79.23%、76.64%；pH為7、10時(shí)，Brij-35的15 h去除率低于65%，pH 6降低至48%。由圖3C可知，在pH 8時(shí)15 h COD去除率比其他pH條件下的COD去除率高23.53%～39.67%。由圖3A、B可知，菌株YX3的生長與Brij-35降解趨勢(shì)一致，表明菌株YX3在中性偏堿性條件下生長代謝活性更高，且在pH 8時(shí)最佳。

圖3 不同pH下YX3的生長曲線、 Brij-35及COD去除率變化研究Fig.3 The growth curve, Brij-35 and COD removal efficiency of strain YX3 under different pH conditions

不同底物濃度下菌株YX3的生長與Brij-35的降解效果如圖4所示。由圖4A可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50～750 mg/L時(shí)，15 h內(nèi)的菌株YX3的生長狀況良好，當(dāng)?shù)孜餄舛确謩e為100、1 000 mg/L時(shí)，菌體生長受到抑制。由圖5B可知，當(dāng)Brij-35濃度分別為100、250、500、750、1 000 mg/L時(shí)，其在15 h內(nèi)的Brij-35去除率分別為42.65%、72.46%、30.61%、27.31%、24.75%。由圖4C可知，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?50 mg/L時(shí)，COD去除率達(dá)到最高50.41%；同時(shí)，隨著底物濃度的增加，COD的去除率越低，這與Brij-35的降解趨勢(shì)基本吻合(圖4B)。由圖4可知，本研究中菌株YX3的最適生長底物濃度為250 mg/L。并且COD的去除率小于Brij-35的去除率，這就說明COD的去除相比Brij-35的降解具有滯后性。其原因可能是，脂肪醇聚氧乙烯醚的初級(jí)生物降解主要通過末端烷基鏈，形成與聚乙基鏈具有相同長度的聚乙二醇(PEG)與脂肪醇以及由烷基部分產(chǎn)生的脂肪酸三者[36～38]，菌株完成初級(jí)降解形成的PEG為主要中間代謝產(chǎn)物[37, 39]，低溫會(huì)降低PEG和脂肪醇代謝過程的速度，延長進(jìn)一步降解的的時(shí)間[22]，因此COD去除率要低于Brij-35去除率。

圖4 不同底物濃度下YX3的生長曲線、 Brij-35及COD去除率變化研究Fig.4 The growth curve, Brij-35 and COD removal efficiency of strain YX3 under different substrate concentrations

3.3 不同pH、底物濃度下菌株YX3的降解動(dòng)力學(xué)

對(duì)菌株YX3在不同pH和底物濃度下的Brij-35降解情況進(jìn)行擬合，結(jié)果見表1、表2。不同pH、底物濃度下，菌株YX3對(duì)Brij-35的降解情況均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，擬合方程相關(guān)系數(shù)(R2)分別大于等于0.95、0.81，能較好地反映菌株YX3對(duì)Brij-35的降解性能。當(dāng)pH在6.0～8.0時(shí)，隨著pH的升高，Brij-35降解半衰期(t1/2)由15.25h縮短至7.46 h，并且隨著pH值的繼續(xù)升高，半衰期(t1/2)延長至11.13 h；在底物濃度為100～250 mg/L時(shí)，隨著底物濃度的增加，Brij-35降解半衰期(t1/2)由19.02 h縮短至8.27 h，并且隨著底物濃度的繼續(xù)增加，半衰期(t1/2)延長至45.55 h。

表1 不同不同pH條件下菌株YX3對(duì) Brij-35降解的擬合結(jié)果Tab.1 Degradation kinetics of Brij-35 at different pH conditions by strain YX3

表2 不同底物濃度時(shí)菌株YX3對(duì)Brij-35降解的擬合結(jié)果Tab.2 Degradation kinetic of Brij-35 at different substrate concentrations by strain YX3

不同pH和底物濃度均對(duì)菌株YX3的降解特性產(chǎn)生影響。一級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果表明，以Brij-35為唯一碳源時(shí)，YX3菌株在低溫(10℃)下的最適降解條件為：pH 8.0，初始Brij-35濃度為250 mg/L。有研究表明，表面活性劑濃度的增加還會(huì)降低生物降解過程的速率和生物降解性[27, 40]。

圖5 YX3在最適生長條件下的生長 曲線與Brij-35濃度變化情況Fig.5 The growth curve of strain YX3 under the optimal growth conditions

由圖5可知，在菌株最適生長條件(pH 8、Brij-35濃度250mg/L)下，YX3菌經(jīng)2 h適應(yīng)期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，并在18 h達(dá)到最大OD600值，隨后菌株經(jīng)過短暫穩(wěn)定期(18～20 h)后迅速進(jìn)入衰亡期。整個(gè)降解過程中，Brij-35濃度在菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)期后呈指數(shù)下降，后期隨著底物濃度的減少降解速率顯著減慢。Jurado[40]等人也發(fā)現(xiàn)，脂肪醇聚氧乙烯醚濃度在菌株完成適應(yīng)期后呈指數(shù)下降。15 h時(shí)Brij-35的去除率達(dá)到85.43%，24 h時(shí)達(dá)到95.80%。擬合降解動(dòng)力學(xué)方程：lnc=-0.148t+5.61，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.98，半衰期(t1/2)為6.1 h。

3.4 菌株YX3對(duì)Brij-30的降解效果考察

由圖6可知，YX3菌株對(duì)Brij-30同樣具有降解作用，具有降解廣泛性。培養(yǎng)15 h，Brij-30的去除率達(dá)94.32%。YX3菌對(duì)Brij-30的降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程特征，通過擬合得到方程：lnc=-0.189t+5.78，擬合相關(guān)系數(shù)(R2)為0.93，半衰期(t1/2)為5.04 h。YX3菌株對(duì)Brij-30的降解要比Brij-35容易。乙氧基化物長度和烷基鏈的線性度是影響非離子表面活性劑生物降解性能的基本因素[41]。Brij-30與Brij-35屬于具有同類烷基鏈不同長度乙氧基化合物的非離子表面活性劑。乙氧基化物的長度與環(huán)氧乙烷單元(EO)的數(shù)量相關(guān)，單元數(shù)量越多，乙氧基化合物越長，Brij-35具有23個(gè)環(huán)氧乙烷單元(EO)，Brij-30具有4個(gè)EO單元。Jurad等[40]對(duì)一系列具有不同數(shù)量EO單元(3、4、6、11)脂肪醇乙氧基化物進(jìn)行生物降解特性研究發(fā)現(xiàn)乙氧基化物鏈上環(huán)氧乙烷單元EO單元數(shù)目越大，達(dá)到同樣生物降解值所需時(shí)間與對(duì)應(yīng)生物降解率的差值似乎越大，即EO單元的數(shù)量與降解時(shí)間呈正相關(guān)，與降解率呈反向關(guān)。通過本實(shí)驗(yàn)也同樣驗(yàn)證了EO數(shù)的增加，會(huì)使初級(jí)生物降解度下降。

圖6 YX3菌對(duì)Brij-30生物降解的時(shí)程曲線Fig.6 The time history curve of biodegradation processes of Brij-30 by strain YX3

4 結(jié) 論

4.1 本文篩選出一株在低溫下能高效降解Brij-35的菌株Acinetobactersp.YX3，其GenBank登錄號(hào)為MK138620。

4.2 菌株YX3的最適pH值8、底物濃度為250 mg/L，24 h的Brij-35去除率最高可以達(dá)到95.80%，且隨著pH的升高或降低，降解作用均減弱。初始Brij-35濃度的升高有利于YX3菌的生長代謝，但在高濃度(500 ～1 000 mg/L)下菌株降解速度出現(xiàn)明顯減慢，菌株生長緩慢。

4.3 菌株YX3對(duì)Brij-35的降解在不同pH和初始濃度下均符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，半衰期(t1/2)最短為7.46 h；其最適生長條件為pH 8，初始Brij-35濃度250 mg/L，此時(shí)半衰期(t1/2)縮短至7.46 h。

4.4 菌株YX3對(duì)脂肪醇聚氧乙烯醚Brij-30同樣具有降解作用，證明該菌株具有降解廣泛性。

綜上所述，溫度是影響微生物活性和降解性能關(guān)鍵因素，而低溫對(duì)污染物的處理效果有明顯抑制作用。本文通過長期低溫馴化篩選出一株Brij-35低溫高效降解菌，并研究了該菌株在不同pH及底物濃度下的降解性能、降解動(dòng)力學(xué)及底物降解廣泛性，為低溫下同類型非離子表面活性劑污染物有效處理提供了優(yōu)質(zhì)的菌種資源。