范蕊 ，吳宗輝，陳曉琳，鄒佐強(qiáng)，龍在云，姚蘭，李斌

1.西南大學(xué)醫(yī)院，重慶市 400715；2.西南大學(xué)運(yùn)動康復(fù)研究所，重慶市 400715；3.陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所第三研究室，創(chuàng)傷與燒傷國家重點(diǎn)實(shí)驗室，重慶市 400042

創(chuàng)傷性脊髓損傷(traumatic spinal cord injury,TSCI)有較高發(fā)病率和死亡率[1]。國內(nèi)一項Meta 分析指出[2]，我國TSCI年患病率為37人次/100萬，多發(fā)于中青年人群，提示我國TSCI疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重。交通事故、高空墜落、跌倒和創(chuàng)傷為主要TSCI的致傷原因[3]。長期的廢用和失神經(jīng)支配以及脊髓緩慢的修復(fù)過程，均使下肢肌肉發(fā)生嚴(yán)重萎縮，從而影響患者生活質(zhì)量和日常行為活動，給患者和社會造成較大負(fù)擔(dān)。研究表明[4?7]，多種信號通路可通過調(diào)控肌纖維類型的轉(zhuǎn)化、肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化功能的改變、蛋白降解及合成的失衡等機(jī)制，介導(dǎo)脊髓損傷后下肢骨骼肌萎縮。

針灸對于延緩脊髓損傷后肌肉萎縮的療效顯著[8?10]。但目前基礎(chǔ)研究大多從促進(jìn)脊髓修復(fù)方面探尋針灸對脊髓損傷的作用機(jī)制[11?12]，而電針對延緩脊髓損傷后靶肌肉萎縮的研究尚不深入。本研究通過電針干預(yù)TSCI大鼠，觀察腓腸肌中肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)、肌肉特異性環(huán)指蛋白1 (muscle?specific ring finger protein 1,MuRF1，由Trim63基因編碼)、肌肉萎縮盒F蛋白32(F?box only protein 32,Atro?gin?1，由Fbxo32 基因編碼)、成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,Myod)和肌細(xì)胞生成素(myo?genin,Myog)的表達(dá)變化，探討電針干預(yù)延緩TSCI相關(guān)肌萎縮的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物及分組

清潔級健康成年雌性Sprague?Dawley 大鼠45 只，體質(zhì)量(200±20) g，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所實(shí)驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(渝)2012?0005。大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，明暗12 h 交替，飲食水自由攝取。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(n=12)和造模組(n=33)。實(shí)驗過程中動物處置均符合陸軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑和儀器

Trizol 總RNA 提取液、RR037A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMII、MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod、Myog、β?Actin 引物合成：日本TAKARA 公司。水合氯醛、蘇木素?伊紅(Hematoxylin?Eosin,HE)染液試劑盒：中國索萊寶公司。漢醫(yī)牌無菌針灸針：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。SDZ?II型電子針治療儀：蘇州醫(yī)療用品有限公司。柔軟型實(shí)驗大鼠固定器：溫州原上草醫(yī)療科技有限公司。精密電子天平：美國SE?TRA 公司。全能臺式通用高速冷凍離心機(jī)：德國HERAEUS 公司。實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real?time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)儀：美國APPLIED BIOSYSTEMS 公司。正置顯微鏡和照相系統(tǒng)：OLYMPUS 公司。Image?Pro Plus 6.0(IPP 6.0)圖像分析軟件。

1.3 動物模型制備

通過重物打擊方法制備大鼠TSCI模型[13]。所有大鼠予4%水合氯醛溶液10 mg/kg 腹腔注射麻醉后常規(guī)備皮，俯臥位固定，以T9棘突為中心做一個長約2～3 cm的縱向切口，剝離筋膜切開椎板后暴露T9節(jié)段胸髓。造模組采用Allen 法將10 g 打擊棒從2.5 cm 高度自由落下，撞擊并損傷T9胸髓。假手術(shù)組僅暴露T9胸髓，不予以撞擊損傷，之后逐層縫合傷口。打擊后損傷處脊髓出現(xiàn)出血腫脹，致傷瞬間尾部會痙攣性擺動，雙下肢及軀體回縮撲動后，出現(xiàn)雙下肢癱瘓即為造模成功。術(shù)后假手術(shù)組全部存活，而造模組成功存活24 只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組(n=12)和電針組(n=12)。

1.4 電針刺激方法及參數(shù)選擇

造模后1 d，電針組予以電針干預(yù)，將大鼠固定于柔軟型實(shí)驗大鼠固定器[14]，參照并改進(jìn)呂威等[15]針刺方法，用直徑0.25 mm、長13 mm 的一次性無菌針灸針電針大椎、命門和雙側(cè)足三里穴干預(yù)，進(jìn)針5～7 mm。干預(yù)參數(shù)2.0 Hz，1.0 mA，連續(xù)波，每次10 min，每天1次，每周6次，連續(xù)干預(yù)28 d。

假手術(shù)組和模型組每天予以相同方法固定，但不予電針干預(yù)。

1.5 BBB(Basso?Beattie?Bresnahan)評分

術(shù)前，術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d和28 d，對每組進(jìn)行BBB 行為學(xué)評分。每只大鼠每次觀察5 min，共觀測3次，以3次平均值作為最終結(jié)果。0分表示完全性截癱，21分表示正常。為盡量避免主觀因素影響評分結(jié)果，BBB評分的實(shí)際操作均通過雙人、單盲方法進(jìn)行。同時，為避免因膀胱充盈而影響大鼠行為，每只大鼠在進(jìn)行BBB評分前需確認(rèn)排空膀胱。

1.6 腓腸肌濕重比

術(shù)前和術(shù)后28 d 針刺干預(yù)結(jié)束后，將大鼠置于電子天平上稱取體質(zhì)量。大鼠腹腔注射4%水合氯醛10 mg/kg 麻醉，快速并完整剝離雙側(cè)腓腸肌，吸干其表面殘留液體，電子天平稱取肌濕重。計算雙側(cè)腓腸肌濕重比。

1.7 腓腸肌纖維橫截面積和直徑

腓腸肌離體后，一部分組織置于4%多聚甲醛中固定2 d，后經(jīng)梯度酒精脫水、浸蠟、包埋后制備石蠟切片并進(jìn)行HE 染色。每組選取左、右側(cè)各12 張切片置于200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5 個視野拍照，每個視野隨機(jī)選取5 個細(xì)胞，經(jīng)IPP 6.0 圖像分析軟件計算各組大鼠腓腸肌纖維橫截面積和直徑。

1.8 qPCR

取各組冰凍保存的腓腸肌樣本約50 mg，用Trizol法提取總RNA；檢測總RNA 濃度及純度后分別按RR037A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟配置反應(yīng)體系，置于T100?PCR 儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，按照SYBR Green法 配制Mix 反應(yīng) 體系25 μl (SYBR 12.5 μl；前引 物1 μl；后引物1 μl；cDNA 溶液2 μl；DEPC 水8.5 μl)后上機(jī)進(jìn)行qPCR 反應(yīng)并讀取Ct 值。以Folds=2?ΔΔCt表示模型組、電針組和假手術(shù)組目的基因表達(dá)的倍比關(guān)系，計算公式如下：ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ?Actin)模型組/電針組-(Ct目的基因-Ctβ?Actin)假手術(shù)組，重復(fù)12 次，計算平均值。上下游引物序列見表1。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料采用(xˉ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗，方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BBB評分

術(shù)前各組BBB 評分均＞20 分，且無顯著性差異(P ＞0.05)。術(shù)后3 d、7 d、14 d、21 d 和28 d，模型組BBB 評分明顯低于假手術(shù)組(P ＜0.01)，術(shù)后7 d、14 d、21 d 和28 d，電針組BBB 評分明顯高于模型組(P ＜0.01)。見表2。

2.2 腓腸肌濕重比

術(shù)前各組體質(zhì)量無顯著性差異(P ＞0.05)。術(shù)后28 d，模型組體質(zhì)量明顯低于假手術(shù)組(P ＜0.01)；模型組左、右側(cè)腓腸肌濕重和腓腸肌濕重比均明顯低于假手術(shù)組(P ＜0.01)；電針組左、右側(cè)腓腸肌濕重和腓腸肌濕重比均明顯高于模型組(P ＜0.01)。見表3。

2.3 腓腸肌形態(tài)學(xué)

與假手術(shù)組相比，模型組、電針組腓腸肌纖維變小，電針組略大于模型組。見圖1。術(shù)后28 d 后，與假手術(shù)組比較，模型組雙下肢腓腸肌纖維橫截面積和直徑明顯減小(P ＜0.01)；電針組雙下肢腓腸肌纖維截面積和直徑大于模型組(P ＜0.05)。見表4。

表2 各組術(shù)后各時間點(diǎn)BBB評分

表3 各組手術(shù)前后體質(zhì)量及術(shù)后28 d腓腸肌濕重和肌濕重比

圖1 各組術(shù)后28 d腓腸肌形態(tài)學(xué)比較(HE染色，×200)

表4 各組術(shù)后28 d雙側(cè)腓腸肌纖維橫截面積和直徑

2.4 腓腸肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod 和Myog mRNA相對表達(dá)量

術(shù)后28 d，與假手術(shù)組比較，模型組腓腸肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod 和Myog mRNA 表達(dá)增加(P ＜0.05)，電針組MSTN、Trim63 和Fbxo32 mRNA 表達(dá)均低于模型組(P ＜0.05)，Myod 和Myog mRNA表達(dá)高于模型組(P ＜0.05)。見表5。

3 討論

脊髓損傷后，下肢肌肉由于長期處于失神經(jīng)支配和廢用狀態(tài)而發(fā)生嚴(yán)重肌萎縮。本實(shí)驗通過重物打擊大鼠T9胸髓制備TSCI模型，觀察電針干預(yù)對TSCI大鼠雙下肢腓腸肌萎縮的延緩作用，并探討其可能機(jī)制。目前基礎(chǔ)研究中，多數(shù)以BBB 評分為指標(biāo)衡量TSCI大鼠下肢運(yùn)動功能[13,16]，以下肢肌肉的肌濕重比、肌纖維橫截面積和直徑[17]為指標(biāo)衡量肌肉萎縮程度。TSCI模型制備成功后，上述肌肉相關(guān)指標(biāo)均有不同程度的下降。本實(shí)驗結(jié)果表明，電針干預(yù)大椎、命門和雙側(cè)足三里穴不僅能有效提高BBB評分，改善大鼠下肢功能活動，還能有效延緩TSCI大鼠雙側(cè)腓腸肌濕重比及肌纖維橫截面積和直徑的下降，與前期研究結(jié)果[18?19]相似，提示電針干預(yù)能有效延緩TSCI誘導(dǎo)的雙下肢肌萎縮。

脊髓解剖與中醫(yī)學(xué)的督脈基本一致，脊髓損傷所致的下肢癱瘓和肌肉萎縮等癥狀屬于中醫(yī)學(xué)中的“體惰”“痿證”范疇?！鹅`樞·寒熱篇》指出[20]：“若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰：體惰”。臨床多主張通督脈而壯陽氣，治療以活血化瘀、祛瘀通督、益氣通絡(luò)為主[21]。命門為督脈要穴，具有培元固本、強(qiáng)健腰膝的功能。大椎為手足三陽、督脈之會，具有和解少陽以驅(qū)邪外出的功能，足三里為足陽明胃經(jīng)合穴，具有強(qiáng)健筋骨、舒筋活血、補(bǔ)中益氣等功能?，F(xiàn)代研究表明[22]，督脈電針干預(yù)能通過增加大鼠脊髓損傷局部腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3 的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)和下肢功能康復(fù)。本研究通過電針干預(yù)大鼠命門、大椎和雙側(cè)足三里穴，共奏疏通督脈、溫腎壯陽、益氣化瘀的功效，延緩TSCI大鼠下肢肌肉萎縮。

表5 術(shù)后28 d各組腓腸肌中MSTN、Trim63、Fbxo32、Myod和Myog mRNA相對表達(dá)量

脊髓損傷所致下肢肌肉萎縮的相關(guān)機(jī)制復(fù)雜。MSTN 被認(rèn)為在這一過程中發(fā)揮著重要作用。MSTN是轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor?β,TGF?β)超家族的成員。作為強(qiáng)有力的骨骼肌負(fù)向調(diào)控因子，MSTN 具有抑制肌蛋白的合成、促進(jìn)肌蛋白降解和抑制骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的功能[23?24]。上述功能的實(shí)現(xiàn)主要通過其下游信號通路Smads 蛋白介導(dǎo)完成。多數(shù)研究表明[25]，脊髓損傷后下肢骨骼肌中MSTN 的表達(dá)增加，磷酸化的Smad2/3 在胞內(nèi)與Smad4 形成復(fù)合物并被轉(zhuǎn)運(yùn)到核內(nèi)，Smads 復(fù)合物在細(xì)胞核中與相關(guān)核因子及DNA 結(jié)合，進(jìn)而激活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)骨骼肌萎縮。而脊髓損傷后，下肢肌肉失去神經(jīng)支配，泛素?蛋白酶路徑被激活，肌肉特異性泛素蛋白連接酶E3(Atrogin?1 和MuRF1)與目標(biāo)靶蛋白結(jié)合，形成泛素?蛋白復(fù)合物后傳遞給26S 的蛋白酶體，促進(jìn)肌蛋白降解[26?28]。本研究結(jié)果表明，電針干預(yù)后能明顯下調(diào)MSTN、Trim63 和Fbxo32 mRNA 的表達(dá)，下調(diào)蛋白降解水平，延緩TSCI大鼠下肢肌萎縮。

另外，骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖分化功能對骨骼肌的修復(fù)具有重要作用。Myod和Myog均為生肌調(diào)節(jié)因子家族成員，對肌衛(wèi)星細(xì)胞的分化起重要調(diào)控作用[29?31]。其中，Myod 為初級分化因子，主導(dǎo)成肌分化；Myog 為次級分化因子，主導(dǎo)肌管的終末分化。本研究結(jié)果表明，電針干預(yù)能有效上調(diào)大鼠腓腸肌中Myod和Myog mRNA的表達(dá)，提示電針干預(yù)可能通過促進(jìn)TSCI大鼠腓腸中肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化，促進(jìn)新生肌管的形成，進(jìn)而延緩下肢肌萎縮。

綜上所述，我們推斷電針干預(yù)TSCI大鼠命門、大椎和雙側(cè)足三里穴可能通過下調(diào)腓腸肌中MSTN、Trim63 和Atrogin?1 的表達(dá)，抑制肌蛋白的過度降解，同時增加Myod和Myog的表達(dá)，促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的成肌分化，從而有效延緩大鼠雙下肢的腓腸肌萎縮。