汪晶　楊忠輝　彭毛才讓　陳惟思　索果佳　黃一平　曹鵬　項欠本

【摘 要】 目的：建立藏藥秦紫消癖丸的質(zhì)量標準。方法：采用顯微鑒別法對秦艽花、塞北紫堇進行鑒別;薄層色譜法對制劑中秦艽花、塞北紫堇進行定性鑒別;采用高效液相色譜法對制劑中龍膽苦苷、獐牙菜苷進行含量測定，色譜柱為X-Bridge C18柱 （ 250 mm×4.60 mm，5 μm ）;流動相為甲醇-0.4%甲酸水（22∶78）;流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;檢測波長為245 nm。結果：TLC斑點清晰，分離度好，陰性無干擾;龍膽苦苷、獐牙菜苷分別在質(zhì)量濃度24.2950 ～ 194.3600 μg/mL（r=0.9997）、6.6950 ～53.5600 μg/mL（r=0.9997）范圍內(nèi)呈良好的線性關系，平均加樣回收率分別為100.04%（RSD=1.52%），100.02%（RSD=2.59%）。結論：研究建立的方法穩(wěn)定性、重復性好，可用于秦紫消癖丸的質(zhì)量控制。

【關鍵詞】 秦紫消癖丸;質(zhì)量標準;龍膽苦苷;獐芽菜苷;原阿片堿

【中圖分類號】R29 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2019）13-0052-05

藏族醫(yī)藥具有民族特色，是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分。藏藥秦紫消癖丸系青海省海南州藏醫(yī)院治療乳腺增生的臨床經(jīng)驗方，由秦艽花、塞北紫堇、冬葵葉、水柏枝等5味藥材組成，具有調(diào)補沖任、化痰軟堅、祛瘀散結等功效，主要用于乳腺增生癥，癥見乳房疼痛及乳房腫塊[1]。該制劑傳統(tǒng)劑型為水泛丸，制備工藝繁瑣，周期長，且微生物限度難以控制[2-4]，而改進后的濃縮丸將冬葵葉、水柏枝進行水提取后與其他三味藥材細粉混勻，采用塑制法制丸，生產(chǎn)效率大大提高，服用量減小，為適應中藥制劑制造規(guī)范化、標準化，為了提高藥品質(zhì)量標準，保證臨床療效及用藥安全，試驗進行秦紫消癖丸質(zhì)量標準研究，分別采用顯微鑒別、薄層色譜鑒別、HPLC等方法對制劑進行質(zhì)量控制，以期為民族藥醫(yī)療機構制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠的實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 LC高效液相色譜儀公司（四元泵、自動進樣器、DAD檢測器、柱恒溫箱;美國安捷倫）;ZF-20C暗箱式紫外分析儀;AT 201型1/10 萬以及 XP6 型 1/100萬電子天平電子天平（瑞士梅特勒公司）;KQ-5200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;AK-55型流水式粉碎機、AW-96型臺式全自動制丸機（溫嶺市奧力中藥機械有限公司）;Millipore型純水器（美國Millipore公司）;硅膠G、GF254薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 龍膽苦苷對照品（ 批號： 110770-201515，中國食品藥品檢定研究院）;獐牙菜苷對照品（批號：MUST-17073009，成都曼思特生物科技有限公司）;原阿片堿對照品（批號為： 110853-201404，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA公司）;水為超純水;其余試劑均為分析純。秦紫消癖丸樣品（批號：20170601、20170602、20170603，江蘇省中醫(yī)藥研究院）。

2 方法與結果

2.1 顯微鑒別 取本品加少量水溶散后，過濾，濾渣再用水合氯醛加熱透化，稀甘油封片，鏡檢，記錄顯微特征。結果：花粉粒類圓球形，表面雕紋不明顯，直徑36 μm[5]，有3個萌發(fā)孔（秦艽花）。葉表皮細胞不規(guī)則形，垂周壁平直或彎曲，氣孔不定式，副衛(wèi)細胞4～5個（塞北紫堇）。顯微特征如圖1。

2. 2 TLC鑒別

2.2.1 秦艽花 取藏藥秦紫消癖丸1.0g，研細（過4號篩），置于100mL三角錐形瓶中，加入甲醇25mL，超聲處理30min，將溶液搖勻，用濾紙濾過，制備成供試品溶液[6-8];另取龍膽苦苷對照品適量，加甲醇制成每 lmL含1mg的溶液，作為對照品溶液。按處方工藝制備得不含秦艽花丸劑，以相同方法制成陰性對照品溶液[9]。照《中國藥典》2015 年版四部通則0502薄層色譜法試驗[10]，吸取對照品溶液1μL，供試品溶液和對照品溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254 薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（ 20∶2∶1 ）為展開劑，預飽和15min，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。由圖2可知，供試品色譜在與對照品色譜相應位置上有顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾[11-13]。

2.2.2 塞北紫堇 取藏藥秦紫消癖丸5.0g，研細（過4號篩），置于三角錐形瓶中，加二氯甲烷-甲醇-濃氨試液 （ 5∶1∶0.1 ）混合溶液40 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液濃縮至干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液[14-16]。另取原阿片堿對照品，加甲醇制成每lmL含1mg 的溶液，作為對照品溶液。按處方工藝制備得不含塞北紫堇丸劑，以相同方法制成陰性對照品溶液[17-18]。照薄層色譜法試驗，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（ 10∶8∶2∶0.3 ）為展開劑，預飽和15min，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液[19]。供試品色譜在與對照品色譜相應位置上有顯相同顏色斑點，陰性對照無干擾。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性 采用X-Bridge C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）;流動相為甲醇-0.4%甲酸水（22∶78）;流速1.0 mL/min;柱溫25 ℃;采用DAD紫外檢測器檢測，檢測波長為245 nm;進樣量10 μL，理論塔板數(shù)按龍膽苦苷計算，應不低于4000[20-22]。

2.3.2 溶液制備 對照品溶液的制備：稱取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解，定容，即得0.4859 mg/mL龍膽苦苷貯備液。稱取獐牙菜苷對照品適量，精密稱定，甲醇溶解并定容至量瓶中，即得0.1339 mg/mL獐牙菜苷貯備液。分別精密吸取上述溶液5 mL于10 mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，即得含龍膽苦苷0.2429 mg/mL、獐牙菜苷0.0669 mg/mL的混合對照品溶液。

供試品溶液的制備：將丸劑研細，取約0.4 g，精密稱定，置三角錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，取出，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，取少量溶液于離心管中高速離心，上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過，即得。

陰性對照溶液制備：按處方比例稱取除秦艽花以外的藥材，按本品制備工藝及供試品制備方法制成陰性對照溶液。

2.3.3 專屬性考察 分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10μL，在“2.3.1”項下色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，龍膽苦苷及獐牙菜苷色譜峰在供試品、對照品溶液色譜圖中保留時間一致，陰性供試品在此處未有吸收峰，表明在上述HPLC測定條件下，無陰性干擾，建立的方法專屬性良好。結果見圖4。

2.3.4 線性關系考察 精密量取混合對照品溶液0.5、1、2、3、4mL置于5mL量瓶中，70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密吸取10μL，分別注入高效液相色譜儀，按“2.3.1”項下色譜條件測定。以對照品濃度對峰面積進行線性回歸分析，得到回歸方程分別為龍膽苦苷Y=11.787X+15.009（r=0.9997）、獐牙菜苷Y=17.073X-10.094（r=0.9997），線性范圍分別24.295～194.360、6.695～53.560μg·mL-1，結果表明線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液（含龍膽苦苷0.0972mg/mL、獐芽菜苷0.0268mg/mL）10μL，按上述色譜條件連續(xù)進樣6次，測得龍膽苦苷與獐牙菜苷峰面積RSD分別為1.08%、1.70%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取同一批樣品，研細，按供試品制備方法平行制備6份，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷平均含量分別為6.0510，2.0307mg/g， RSD分別為2.90% 、2.31%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12，24h進樣測定，測得龍膽苦苷、獐牙菜苷峰面積的RSD分別為2.28%、 2.57%，表明在室溫條件下，供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取已測定的樣品0.2g，精密稱定，共6份，分別精密加入龍膽苦苷與獐牙菜苷混合對照品溶液（含龍膽苦苷0.2429mg/mL、0.0669mg/mL） 5mL，按“2.3.2”項下供試品制備方法制備樣品，進樣量為10μL，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

2.3.9 樣品含量測定 分別取3批秦紫消癖丸樣品，精密稱定，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.3.1”項下色譜條件進樣測定，計算龍膽苦苷和獐芽菜苷含量，測定結果見表2。參考3批樣品含量測定結果，暫將樣品含量限度定為本品含龍膽苦苷不得低于5.4 mg/g，獐芽菜苷不得低于1.8 mg/g。

3 討論

藏藥秦紫消癖丸是根據(jù)傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論，采用現(xiàn)代制劑技術將秦紫消癖丸制成濃縮丸，減小了服用量，提高了患者的依從性;降低微生物污染幾率;提高生產(chǎn)效率，促進民族藥現(xiàn)代化的發(fā)展。

秦紫消癖丸中秦艽花的花粉粒、塞北紫堇的氣孔易檢出，其特征明顯，但專屬性較差，因此未列入質(zhì)量標準中。在鑒別秦艽花的TLC試驗中，以乙酸乙酯-甲醇-水（10∶2∶1）、乙酸乙酯-甲醇-水（20∶2∶1）不同比例展開劑比較斑點分離情況后選擇分離效果更好的乙酸乙酯-甲醇-水（20∶2∶1）為展開條件;在鑒別塞北紫堇TLC試驗中，比較不同展開系統(tǒng)環(huán)己烷-乙酸乙酯-二乙胺（16∶3∶1）、正己烷-乙酸乙酯-三乙胺（16∶3∶2）、正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3），確定了以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-氨水（10∶8∶2∶0.3）為展開系統(tǒng)的分離效果最佳，選擇改良碘化鉍鉀試液為顯色劑，顯色清晰。在TLC鑒別試驗中水柏枝與冬葵葉陰性有干擾，故未列入質(zhì)量標準。

在HPLC含量測定時，通過全波長掃描發(fā)現(xiàn)龍膽苦苷在245 nm和275 nm均有較大吸收，獐牙菜苷在245 nm處有最大吸收，且無陰性干擾，所以選擇245 nm處為檢測波長。供試品溶液制備過程中比較了回流提取與超聲提取，結果發(fā)現(xiàn)對秦艽花中龍膽苦苷的提取并無顯著性區(qū)別，考慮到超聲提取操作更加簡便，選擇超聲提取。提取溶劑比較了30%、50%、70%、100%濃度甲醇，發(fā)現(xiàn)30%、50%、100%濃度的甲醇提取的龍膽苦苷峰均拖尾，70%甲醇提取時龍膽苦苷峰形好，提取率更高，因此選擇70%甲醇為提取溶劑。比較了乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.4%甲酸水等多種流動相體系，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.4%甲酸水為流動相洗脫時分離效果最好;本文的研究工作為秦紫消癖丸的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2019-04-09 編輯：劉斌）