席 溢,趙麗麗,王小利,曾慶飛,陳 超*

石漠化地區(qū)野生多花木藍根瘤資源調(diào)查與分析

席 溢1,趙麗麗1,王小利2,曾慶飛2,陳 超1*

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽 550025；2.貴州省草業(yè)研究所,貴州 貴陽 550006)

為充分發(fā)揮豆科植物在生態(tài)恢復(fù)與重建中的作用,調(diào)查了貴州省境內(nèi)石漠化部分地區(qū)的野生多花木藍根瘤資源.結(jié)果表明:隸屬于干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)的野生多花木藍根瘤菌及內(nèi)生細菌資源較為豐富;野生多花木藍的共生結(jié)瘤率只達50%左右,根瘤全部著生于寄主的側(cè)根及須根上,大小可達0.5~3.0mm;12株根瘤菌分布在6個屬10個種,其中慢生根瘤菌屬()的分布頻率最高41.67%,慢生根瘤菌屬的和伯克霍爾德菌屬的發(fā)生頻率最高16.67%;16株根瘤內(nèi)生細菌分布在4個屬11個種,其中芽孢桿菌屬()的分布頻率最高43.75%,芽孢桿菌屬的的發(fā)生頻率最高31.25%.

石漠化；多花木藍；根瘤菌；內(nèi)生細菌；區(qū)系分析

喀斯特地區(qū)生境普遍土層淺薄、巖石裸露率高、保水性差,土壤養(yǎng)分易流失,生態(tài)系統(tǒng)脆弱,易遭破壞且難于恢復(fù).再加上強烈的人為干擾,造成喀斯特地區(qū)土壤侵蝕嚴(yán)重,土地生產(chǎn)力嚴(yán)重下降,最終出現(xiàn)石漠化[1].石漠化治理的關(guān)鍵是提高植被覆蓋度,保持水土,增加土壤中碳、氮、磷含量等.相對化學(xué)手段,通過生物學(xué)手段促進土壤中氮積累,更環(huán)保[2].豆科植物()與根瘤菌()的共生固氮作用,是最重要的生物固氮形式[3].共生固氮量占生物固氮總量的80%左右[4].根瘤菌是與豆科植物共生,在其根部或莖部形成根瘤,并固定空氣中氮氣為植物提供營養(yǎng)的一類革蘭氏染色陰性需氧桿菌[1].因此,相對非豆科植物,豆科植物對土壤中全氮、速效氮和有機碳的改善作用更顯著[6-7].目前,常將豆科植物與非豆科植物進行輪作、套種,以改善土壤質(zhì)量和提高農(nóng)作物產(chǎn)量,并利用共生固氮進行生態(tài)修復(fù)[8].豆科植物被公認(rèn)為逆境生態(tài)恢復(fù)和貧瘠退化土壤修復(fù)最有效的先鋒植物[9],能有效增加植被覆蓋度,減少徑流、泥沙及養(yǎng)分的流失[10].

某些豆科植物與根瘤菌形成固氮共生體的同時,其根瘤內(nèi)還存在多種其他類群的內(nèi)生細菌[11-12].此外,根瘤菌與豆科植物建立共生關(guān)系,不僅需要與寄主相互識別,還受地理環(huán)境的影響[13-14].寄主要適應(yīng)所在環(huán)境,而與其結(jié)瘤的根瘤菌受到寄主和環(huán)境的選擇.

多花木藍()為豆科木藍屬灌木,耐貧瘠性和抗旱性較強,有水土保持作用;蛋白質(zhì)含量高,有多種氨基酸成分,具有一定的飼用價值.研究表明,多花木藍也是結(jié)瘤植物之一[15],其根瘤菌具有豐富的遺傳多樣性[16].貴州是我國唯一沒有平原支撐的內(nèi)陸山區(qū)省份,喀斯特環(huán)境獨特,針對該地區(qū)野生多花木藍根瘤資源系統(tǒng)研究工作缺乏[17-18].

本研究采集了貴州省境內(nèi)石漠化部分地區(qū)的多花木藍根瘤資源,分離純化根瘤菌株,采用16S rDNA序列分析比對,鑒定菌株,并進行了區(qū)系分析.以期挖掘地區(qū)資源,為石漠化地區(qū)生態(tài)恢復(fù)與重建中充分發(fā)揮豆科植物與根瘤菌共生固氮技術(shù)提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 資源調(diào)查區(qū)域及概況

根據(jù)云貴高原地形地貌和天然豆科牧草分布特點,于2016年7月～2017年6月,對貴州省境內(nèi)野生多花木藍根瘤菌資源進行了調(diào)查.調(diào)查范圍涉及全省36個縣(市)(圖1).

圖1 多花木藍根瘤資源調(diào)查區(qū)域的生態(tài)區(qū)及根瘤采集點

依據(jù)《貴州省生態(tài)功能區(qū)劃》[19],調(diào)查區(qū)域涉及了全省全部的生態(tài)區(qū):(1)東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū).德江、沿河、印江、江口、思南、石阡,屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū),年均氣溫13.5~17.6℃,年均降水量1110~1410mm;(2)南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū).興義、安龍、冊亨、望謨、羅甸、平塘、荔波、三都、獨山,屬典型的亞熱帶溫暖溫潤的季風(fēng)氣候,年均氣溫13.6~19.6℃,年均降雨量1100~1400mm;(3)西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū).普安、晴隆、興仁、貞豐,屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候,年均氣溫14.0~19.0℃,年降水量1100~1500mm;(4)北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū).仁懷、桐梓、習(xí)水,屬亞熱帶季風(fēng)氣候,年均氣溫15.1℃,年均降水量1200mm;(5)中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū).貴陽、遵義、湄潭、鳳岡、務(wù)川、正安、道真、惠水、長順、平壩、普定、鎮(zhèn)寧、關(guān)嶺、紫云,屬典型的高原型濕潤亞熱帶季風(fēng)氣候,年均氣溫14℃,年均降雨量1360mm.

1.2 野生多花木藍根瘤標(biāo)本的采集

相鄰采樣點要求路程距離大于15km,或海拔差大于50m.選擇生長狀況良好的植株,采集個大、飽滿根瘤.根瘤裝入離心管中密封、編號,并記錄采集點信息.

1.3 根瘤菌株與內(nèi)生細菌的分離與純化

自來水沖凈樣品泥土,無菌水浸泡直至根瘤吸脹.每份樣品挑選10~20顆個大、飽滿的根瘤,95%酒精浸泡5min,0.1%HgCl2處理5min,無菌水沖洗數(shù)次,轉(zhuǎn)至無菌研缽.加無菌水1000mL,研磨成懸濁液,將懸濁液轉(zhuǎn)到Y(jié)MA平板(加有剛果紅),均勻涂布,恒溫(28℃)倒置培養(yǎng)3~7d后,先后有菌落長出.及時挑取單菌落,進行革蘭氏染色,鏡檢.純化菌株接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)7d(28℃),30%甘油保種,-70℃保藏.

1.4 純化菌株16S rDNA的測定

菌株DNA利用試劑盒(UNIQ-10柱式)提取.引物為P1和P6.PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 5min,變性94℃ 30s,退火54℃ 1min,延伸72℃ 2min;循環(huán)35次;延伸72℃ 10min.純化回收PCR產(chǎn)物,連接質(zhì)粒載體PMD18-T,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α;篩選獲取轉(zhuǎn)化子,驗證提取的質(zhì)粒DNA[20].產(chǎn)物送昆明碩擎生物公司測序.序列結(jié)果利用NCBI中Blast和GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對,確定分離菌株的分類地位.

1.5 根瘤菌株與內(nèi)生細菌的區(qū)系分析

分析根瘤菌及內(nèi)生細菌的種類組成、分布頻率以及優(yōu)勢種類.

相對頻率計算分布頻率和發(fā)生頻率:分布頻率=有某菌種的樣品數(shù)/有菌種的總樣品數(shù);發(fā)生頻率=有某菌種的菌株數(shù)/鑒定出的菌株總數(shù).

2 結(jié)果與討論

2.1 野生多花木藍根瘤資源調(diào)查

在貴州省36個縣(市)不同生態(tài)環(huán)境的野生多花木藍根瘤資源調(diào)查中,共采集到根瘤樣品23份.所采樣品來自于印江、獨山、紫云等13個縣(市)(表1).在東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)、中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)、南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)中的部分縣(市)采集到了野生多花木藍根瘤資源,在北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)和西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)未采集到.調(diào)查中發(fā)現(xiàn),土壤疏松、水分條件正常的環(huán)境條件下,多花木藍長勢較好且根瘤較多,個體大;而土壤板結(jié)、干旱或低洼積水地帶,多花木藍長勢較差,根瘤較少,個體小(圖2).而海拔高度對多花木藍根瘤的數(shù)量與大小沒有直接的影響(表1).

a:根瘤較多根系;b:根瘤

本研究僅在部分區(qū)域采集到野生多花木藍根瘤資源.土壤疏松、水分條件正常的環(huán)境條件下,多花木藍長勢較好且根瘤較多,這應(yīng)與多花木藍的生長習(xí)性有關(guān).有研究也顯示,陰坡或常年陽光照射不足的區(qū)域,干旱氣候下很難采集到根瘤[21].未采集到根瘤資源的北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)和西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū),可能是不適的水分條件造成形成的根瘤脫落,或是土壤條件不利于根瘤的形成,或是缺乏相應(yīng)的根瘤菌[22-23].

表1 野生多花木藍根瘤形態(tài)特征

2.2 野生多花木藍根瘤特征

本次所采集的多花木藍的共生結(jié)瘤率只達50%,且根瘤全部著生于寄主的側(cè)根及須根上,主根上無根瘤著生(圖2).根瘤多為球形和柱狀,少數(shù)為掌狀;顏色呈淺/深褐色、淺/深粉色、白色等;大小可達0.5~3.0mm(表1).

Andrews等[24]研究顯示,一年生豆科植物根瘤主要著生在主根及側(cè)根上部;多年生豆科植物根瘤一般著生在側(cè)根或須根,但少數(shù)種的粗壯主根上也會著生白色或粉紅色幼瘤.本研究中野生多花木藍為多年生植物,結(jié)果也顯示,根瘤都著生于側(cè)根及須根上.根瘤形狀與寄主植物有很大關(guān)系[15].本研究中根瘤多為球形和柱狀,少數(shù)為掌狀.可能因為野生多花木藍作為寄主缺乏永久分生組織,也就是缺乏感染線或感染線分布不廣.由于豆血紅蛋白的存在,具有固氮活性的有效根瘤斷切面呈粉紅色[16].本研究中的根瘤資源主要為淺/深褐色、淺/深粉色、白色.

2.3 根瘤菌株及內(nèi)生細菌的分離純化

從采集的23份野生多花木藍的根瘤樣品中分離得到28個純化菌株.所得菌落表面光滑、濕潤,呈圓形、中間隆起(圖3).

圖3 分離純化的菌落

2.4 根瘤菌株及內(nèi)生細菌的分子鑒定

通過PCR反應(yīng),所有待測菌株均擴增出了約1.5kb的序列片段(圖4).測定序列與NCBI中Blast和已知物種的16S rDNA序列比對得出, 28個菌株中,有根瘤菌12株(表2),內(nèi)生細菌16株(表3).

12株根瘤菌來自于長順縣、冊亨縣、望謨縣、羅甸縣、獨山縣、三都縣(表2).除長順縣外,其他根瘤菌來源地均處于南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)(圖1).

16株根瘤內(nèi)生細菌來自于紫云縣、羅甸縣、平塘縣、獨山縣、三都縣、印江縣、江口縣(表3).大部分根瘤內(nèi)生細菌來源地處于南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)(圖1).

根瘤菌—豆科植物建立的共生關(guān)系有多重因子的復(fù)雜性,環(huán)境對根瘤菌能否結(jié)合共生有重要影響[25].每種植物都有一定的生態(tài)適應(yīng)范圍,環(huán)境影響豆科植物—根瘤菌共生結(jié)瘤可能性和穩(wěn)定性[26].本研究中分離鑒定出的根瘤菌和根瘤內(nèi)生細菌也主要在分布在特定區(qū)域,也說明生態(tài)地理環(huán)境影響野生多花木蘭的結(jié)瘤能力.宿主植物要適應(yīng)環(huán)境壓力,與其結(jié)瘤的根瘤菌要面臨宿主和環(huán)境的選擇,導(dǎo)致菌株呈現(xiàn)區(qū)域差異.

表2 野生多花木藍根瘤菌株分子鑒定結(jié)果

表3 野生多花木藍根瘤內(nèi)生細菌分子鑒定結(jié)果

2.5 根瘤菌株及內(nèi)生細菌的區(qū)系分析

12株根瘤菌分布在6個屬10個種(表4).慢生根瘤菌屬()4個、根瘤菌屬()2個、伯克霍爾德菌屬()1個、中慢生根瘤菌屬()1個、腸桿菌屬()1個、土壤桿菌屬()1個.慢生根瘤菌屬的分布頻率最高41.67%,其次是根瘤菌屬和伯克霍爾德菌屬為16.67%,其他的分布頻率都是8.33%.

與根瘤菌共生固氮是豆科植物的顯著特點.根瘤菌屬于細菌域變形桿菌門[27].本研究分離鑒定的根瘤菌分布在6個屬12個種,其中慢生根瘤菌屬、根瘤菌屬、中慢生根瘤菌屬屬于-變形桿菌綱,伯克霍爾德菌屬屬于-變形桿菌綱.慢生根瘤菌屬分布頻率最高,是優(yōu)勢種群.

表4 野生多花木藍根瘤菌區(qū)系分析

表5 多花木藍根瘤內(nèi)生細菌區(qū)系分析

16株根瘤內(nèi)生細菌分布在4個屬11個種(表5).芽孢桿菌屬()7個、黃單胞菌屬()1個、類芽胞桿菌屬()1個、短芽孢桿菌屬()1個.芽孢桿菌屬的分布頻率最高43.75%,黃單胞菌屬的次之為12.50%,其他的均為6.25%.其中芽孢桿菌屬的和的發(fā)生頻率分別為31.25%和12.50%,其他種的發(fā)生頻率均為6.25%.

除了與根瘤菌共生外,豆科植物還可以與其他微生物形成多種相互關(guān)系;在根瘤內(nèi),也存在其他類群的內(nèi)生細菌[28-29].內(nèi)生細菌可以促進植物生長,提高產(chǎn)出,擔(dān)當(dāng)生物控制因子[30].內(nèi)生細菌的形態(tài)、種類以及生物學(xué)作用也是豐富多樣[31].種類上占較大優(yōu)勢的主要是假單胞菌屬、芽胞桿菌屬、腸桿菌屬和土壤桿菌屬[32].本研究分離鑒定的根瘤內(nèi)生細菌分布在4個屬11個種,其中芽孢桿菌屬的分布頻率最高,芽孢桿菌屬的發(fā)生頻率最高.

3 結(jié)論

3.1 貴州境內(nèi)隸屬于南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)的野生多花木藍根瘤菌及內(nèi)生細菌資源較為豐富.

3.2 從貴州石漠化地區(qū)野生多花木藍根分離鑒定的根瘤菌分布在6個屬(、、、、、)10個種(、、、、、、、、、).

3.2 從貴州石漠化地區(qū)野生多花木藍根分離鑒定的根瘤內(nèi)生細菌分布在4個屬(、、、)11個種(、、、、、、、、、、).

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Investigation and analysis of root nodule resources of wildin rocky desertification areas.

XI Yi1, ZHAO Li-li1, WANG Xiao-li2, ZENG Qing-fei2, CHEN Chao1*

(1.College of Animal Science, Guizhou University, Guiyang 550025, China；2.Guizhou Institute of Pratacultural, Guiyang 550006, China)., 2019,39(10)：4409~4415

In order to give full play to the role of leguminous plants in ecological restoration and reconstruction, the root nodule resources of wildin the rocky desertification region of Guizhou province were investigated. The results showed that the resources of rhizobia and endophytic bacteria of wildwere abundant in southern subtropical seasonal rain forest ecological zone in the dry and hot valley; the symbiotic nodulation rate of wildwas only about 50%, and all the nodules were on the lateral roots and fibrous roots of the host, 0.5~3.0mm in size; 12 rhizobia strains were distributed in 10 species of 6 genera, of which the distribution frequency ofwas the highest in frequency 41.67%, and the frequencies of occurrence ofofandofwere the highest in frequency 16.67%; 16 endophytic bacteria strains were distributed in 11 species of 4 genera, of which the distribution frequency ofwas the highest in frequency 43.75%, and the frequency of occurrence ofofwas the highest in frequency 31.25%.

rocky desertification；；rhizobia；endophytic bacteria；flora analysis

X176

A

1000-6923(2019)10-4409-07

席 溢(1987-),女,貴州安順人,副教授,博士,主要從事植物生理生態(tài)學(xué)研究.發(fā)表論文10余篇.

2019-03-19

貴州省科技重大專項計劃(黔科合重大專項字[2016]3002號);國家自然科學(xué)基金資助項目(31560664);貴州省科技合作計劃(黔科合LH字[2016]7450號)

* 責(zé)任作者, 教授, gzgyxgc3855218@163.com