張 剛 余 瓊 杜 娟

(江漢大學(xué)附屬醫(yī)院武漢市第六醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢430015)

胃癌是發(fā)生于消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，其在世界范圍內(nèi)影響著人類的生命健康，胃癌具有轉(zhuǎn)移快、早期發(fā)病隱匿等特點(diǎn)，多數(shù)患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于胃癌晚期且已經(jīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，胃癌轉(zhuǎn)移是胃癌致死的重要原因之一[1]。延齡草屬于百合科植物，是傳統(tǒng)中藥之一，具有延年益壽、祛風(fēng)活血等作用[2]。最近的研究表明，延齡草總皂苷具有抗腫瘤作用，目前在宮頸癌、結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞中已經(jīng)驗(yàn)證其具有體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移作用尚不明確[3,4]。IL-6/STAT3信號(hào)是與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)的調(diào)節(jié)因子，IL-6表達(dá)上調(diào)可以誘導(dǎo)STAT3發(fā)生磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、遷移和EMT[5]。我們的實(shí)驗(yàn)以明確延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移的作用和機(jī)制為目的，為延齡草總皂苷治療腫瘤的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 胃癌細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自美國(guó)ATCC；MMP-2抗體、STAT3抗體、MMP-9抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma；延齡草總皂苷由湖北大學(xué)中藥生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提取保存；E-cadherin抗體、IL-6抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；Vimentin抗體、p-STAT3抗體購(gòu)自美國(guó)R&D Systems；IL-6重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建。

1.2方法

1.2.1CCK-8檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖影響 胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)之后按照3 000個(gè)/孔接種到96孔板內(nèi)，將細(xì)胞按照0、10、20、40、80、160 mg/L的延齡草總皂苷作用濃度梯度分組，放在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，取出培養(yǎng)板，添加CCK-8溶液10 μl，在避光中反應(yīng)2 h。測(cè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)470 nm 的A值。

1.2.2Transwell小室檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移影響 在Transwell小室中添加50 mg/L 的基質(zhì)膠濕化，置于4℃風(fēng)干，再添加不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液把基底膜水化0.5 h。將小室置于培養(yǎng)板內(nèi)，分別在上室內(nèi)加入100 μl的以不含血清且含有延齡草總皂苷濃度為0、10、20 mg/L的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮的胃癌細(xì)胞，同時(shí)分別在下室內(nèi)加入500 μl含有血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取棉簽把沒(méi)有穿膜的細(xì)胞清除掉，把Transwell小室取出后風(fēng)干，以0.1%的結(jié)晶紫溶液染色30 min，添加PBS洗滌，分別選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞侵襲數(shù)目。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)前不用基質(zhì)膠濕化小室，其余步驟同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.2.3Western blot檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)影響 取0、10、20 mg/L的延齡草總皂苷處理培養(yǎng)48 h后的胃癌細(xì)胞，提取細(xì)胞中總蛋白。按照下述方法進(jìn)行Western blot檢測(cè)：依照BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，分別吸取蛋白樣品加入到5×Loading Buffer溶液中混合(體積比為4∶1)。將電泳液添加到電泳槽內(nèi)，以10%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，每個(gè)泳道內(nèi)蛋白上樣量為30 μg，Marker上樣量為5 μl，設(shè)置80 V的電壓進(jìn)行電泳30 min，再調(diào)整電壓到120 V繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)染料到達(dá)底部之后方可停止電泳。常規(guī)半干法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜參數(shù)為：120 mA，1.5 h。取出NC膜，置于5%牛血清白蛋白封閉液中孵育結(jié)合1.5 h。把NC膜取出，再放置于含有一抗的反應(yīng)液內(nèi)，在4℃過(guò)夜，NC膜與二抗(1∶2 000稀釋)反應(yīng)液在室溫中孵育1.5 h，按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光，用Quantity One分析各蛋白條帶的灰度值，GAPDH作為參照。

1.2.4IL-6慢病毒感染對(duì)延齡草總皂苷抗胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和EMT影響 胃癌細(xì)胞按照常規(guī)方法感染IL-6重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒，MOI=10，感染后24 h換液，繼續(xù)培養(yǎng)3 d感染效率高于90%，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。感染IL-6重組慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒的胃癌細(xì)胞用含有10 mg/L的延齡草總皂苷的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，記為TST+Lv-IL-6組和TST+Lv-NC組，按照Transwell小室方法檢測(cè)細(xì)胞侵襲和遷移能力，按照Western blot方法檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平，步驟同上。

2 結(jié)果

2.1延齡草總皂苷抑制胃癌細(xì)胞增殖 見(jiàn)表1，20、40、80、160 mg/L的延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞增殖能力降低，10 mg/L的延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞增殖沒(méi)有影響。為了消除細(xì)胞增殖對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的影響，選用10 mg/L和20 mg/L的延齡草總皂苷做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移影響 見(jiàn)圖1和表2，延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞細(xì)胞侵襲和遷移數(shù)目均降低，細(xì)胞中侵襲遷移相關(guān)蛋白MMP-9和MMP-2表達(dá)水平均降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細(xì)胞侵襲及遷移。

Total saponins oftrillium concentration(mg/L)A57000.76±0.07100.69±0.05200.56±0.041)400.39±0.031)800.27±0.021)1600.20±0.021)F87.303P0.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

2.3延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin表達(dá)影響 見(jiàn)圖2和表3，延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平升高，Vimentin蛋白表達(dá)水平降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細(xì)胞EMT。

圖1 Western blot檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)影響Fig.1 Western blot to detect effect of total saponins of trillium on expression of MMP-2 and MMP-9 in gastric cancer cells

Total saponinsof trilliumconcentrationNumberof invasionNumberof migrationMMP-2MMP-90 mg/L105.65±10.69 156.32±13.580.63±0.060.66±0.0710 mg/L80.84±7.121)122.83±10.451)0.46±0.041)0.53±0.051)20 mg/L63.87±6.831)99.21±10.761)0.25±0.031)0.28±0.041)F18.77718.10453.45937.300P0.0000.0030.0000.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖2 Western blot檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)影響Fig.2 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells

2.4延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)關(guān)鍵蛋白IL-6、STAT3、p-STAT3表達(dá)影響 見(jiàn)圖3和表4，延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞細(xì)胞中IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)水平降低。延齡草總皂苷能夠體外抑制胃癌細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)激活。

2.5IL-6過(guò)表達(dá)慢病毒提高延齡草總皂苷作用條件下胃癌細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)通路激活水平 見(jiàn)圖4和表5，IL-6過(guò)表達(dá)慢病毒感染后的胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)延齡草總皂苷處理后，細(xì)胞中IL-6、p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高。IL-6過(guò)表達(dá)慢病毒提高延齡草總皂苷條件下胃癌細(xì)胞中IL-6/STAT3信號(hào)激活水平。

Total saponins of trilliumconcentrationE-cadherinVimentin0 mg/L0.34±0.030.73±0.0910 mg/L0.53±0.061)0.42±0.041)20 mg/L0.68±0.081)0.30±0.031)F23.97341.802P0.0010.000

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖3 Western blot檢測(cè)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)影響Fig.3 Western blot analysis of effect of total saponins of trillium on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells

2.6過(guò)表達(dá)IL-6逆轉(zhuǎn)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移和EMT影響 見(jiàn)圖5和表6，IL-6過(guò)表達(dá)慢病毒感染后的胃癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)延齡草總皂苷處理后，細(xì)胞侵襲遷移能力升高，MMP-9、MMP-2和Vimentin蛋白水平升高，E-cadherin蛋白水平降低。過(guò)表達(dá)IL-6能夠逆轉(zhuǎn)延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲遷移和EMT的抑制作用。

Total saponins of trilliumconcentrationIL-6STAT3p-STAT30 mg/L0.86±0.080.70±0.070.58±0.0610 mg/L0.52±0.051)0.71±0.060.39±0.031)20 mg/L0.34±0.041)0.70±0.080.32±0.021)F59.7710.02033.245P0.0000.9800.001

Note：Compared with 0 mg/L,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測(cè)IL-6過(guò)表達(dá)慢病毒載體對(duì)延齡草總皂苷影響胃癌細(xì)胞中IL-6、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)作用Fig.4 Western blot analysis of effect of lentiviral vector over-expressing IL-6 on expression of IL-6,STAT3 and p-STAT3 in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

GroupsIL-6STAT3p-STAT3TST+Lv-NC group0.43±0.040.79±0.080.36±0.03TST+Lv-IL-6 group0.64±0.031)0.80±0.070.54±0.051)t7.2750.163 5.347P0.0020.879 0.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

圖5 Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)IL-6對(duì)延齡草總皂苷影響胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)作用Fig.5 Western blot analysis of effect of IL-6 overexpress-ion on expression of MMP-2,MMP-9,E-cadherin and Vimentin in gastric cancer cells with total saponins of trilliumNote: 1.TST+Lv-Nc group;2.TST+Lv-IL-6 group.

圖6 過(guò)表達(dá)IL-6后經(jīng)延齡草總皂苷處理的胃癌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞侵襲(A)、遷移(B)數(shù)目Fig.6 Expression levels of MMP-2,MMP-9,E-cadherin,Vimentin and number of cell invasion (A) and migration (B) in gastric cancer cells treated with total saponins of trillium after overexpression of IL-6

GroupsNumber of invasion Number of migrationMMP-2MMP-9E-cadherinVimentinTST+Lv-NC group83.65±9.15120.17±11.320.54±0.050.57±0.060.77±0.050.56±0.04TST+Lv-IL-6 group 110.68±11.521)147.25±9.831)0.96±0.101)0.76±0.051)0.50±0.041)0.83±0.081)t3.1823.1296.5074.2147.3045.229P0.0340.0350.0030.0140.0020.006

Note：Compared with TST+Lv-NC,1)P<0.05.

3 討論

我們發(fā)現(xiàn)，延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞的增殖能力降低，細(xì)胞侵襲和遷移能力下降，說(shuō)明延齡草總皂苷具有抗胃癌細(xì)胞體外惡性表型的作用，延齡草總皂苷可能是胃癌治療的有效方法。延齡草屬于多年生草本植物，含有黃酮苷、甾體皂苷等多種化學(xué)成分，具有解毒、止血等功效，常用于治療高血壓、跌打損傷、頭暈?zāi)垦５劝Y狀[6,7]。近年來(lái)的研究報(bào)道顯示，延齡草還具有凝血、消炎等活性，對(duì)于腫瘤具有抑制作用[8]。延齡草總皂苷是提取自中藥延齡草中的活性成分，對(duì)于肺癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞具有體外抗生長(zhǎng)和抑制轉(zhuǎn)移的作用，延齡草總皂苷處理后的乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力降低，細(xì)胞中侵襲和遷移蛋白MMP-9、MMP-2表達(dá)水平降低，延齡草總皂苷可能是腫瘤治療的有效藥物之一[9-11]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究報(bào)道一致，說(shuō)明延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用與其余腫瘤相同，均具有抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能的作用。

本次實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)延齡草總皂苷可以抑制間質(zhì)蛋白Vimentin的表達(dá)并促進(jìn)上皮蛋白E-cadherin的表達(dá)，延齡草總皂苷具有抗胃癌細(xì)胞EMT的作用。腫瘤細(xì)胞EMT與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并且腫瘤細(xì)胞EMT是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期標(biāo)志，EMT的特點(diǎn)為間質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)而上皮標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)[12-16]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了延齡草總皂苷具有抗胃癌細(xì)胞EMT的作用，這為研究延齡草總皂苷抗腫瘤機(jī)制提供了新思路。

IL-6/STAT3是與腫瘤有關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，IL-6具有多種生物學(xué)功能，其可以由腫瘤細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)激活STAT3磷酸化而發(fā)揮腫瘤誘導(dǎo)作用[17,18]。在卵巢癌、胃癌、結(jié)直腸癌等大多數(shù)腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)，阻斷IL-6/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型，其也是目前腫瘤治療的有效靶點(diǎn)之一[19-21]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，延齡草總皂苷處理后的胃癌細(xì)胞中IL-6蛋白和STAT3磷酸化水平降低，并且通過(guò)上調(diào)IL-6表達(dá)水平激活I(lǐng)L-6/STAT3信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)延齡草總皂苷抗胃癌細(xì)胞侵襲遷移和EMT的作用，這說(shuō)明延齡草總皂苷可以通過(guò)抑制IL-6/STAT3信號(hào)激活發(fā)揮抗胃癌作用。

總而言之，本次實(shí)驗(yàn)初步明確了延齡草總皂苷對(duì)胃癌細(xì)胞的作用和機(jī)制，對(duì)于不同來(lái)源的延齡草總皂苷的敏感性及具體的機(jī)制還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行探討。延齡草總皂苷可能是胃癌治療的有效途徑，并且其作用機(jī)制與下調(diào)IL-6/STAT3信號(hào)激活水平有關(guān)，這對(duì)于研究延齡草總皂苷抗腫瘤機(jī)制具有重要意義。本次實(shí)驗(yàn)只在體外進(jìn)行了初步探討，后續(xù)還需要在體內(nèi)和多方面進(jìn)行研究和驗(yàn)證。