李克梅，阿孜古麗·木漢買(mǎi)提，葛瑞云，劉學(xué)學(xué)，李寶義，熱甫卡提·雪合拉提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

苜蓿(Medicagospp.)素有“牧草之王”美譽(yù)，具有適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)草量高，富含蛋白質(zhì)等特性，作為牧草在世界范圍被廣泛種植[1]，也可作為綠肥，改土肥田、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等[2]。目前全世界的苜蓿種植面積為3 300萬(wàn)hm2，其中美國(guó)[3]約1 000萬(wàn)hm2，我國(guó)[4]苜蓿約470萬(wàn)hm2。我國(guó)苜蓿主產(chǎn)區(qū)為東北、華北和西北地區(qū)[5]。

隨著苜蓿種植面積的逐步增加，苜蓿病毒病的發(fā)生狀況呈加重趨勢(shì)，越來(lái)越多的病毒種類(lèi)被發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍存在，引起的癥狀類(lèi)型越來(lái)越多樣化，嚴(yán)重影響苜蓿生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[6]。苜蓿病毒病常表現(xiàn)為花葉、矮化或畸形等癥狀，使之產(chǎn)量降低，難以越冬[7]。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，有多種病毒可以侵染苜蓿[8]，在阿根廷紫花苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus, BLRV)的侵染[9]；在澳大利亞苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有苜蓿矮化病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)和苜蓿卷葉病毒(alfalfa leafroll virus, ALRV)的侵染[10]；在沙特阿拉伯紫花苜蓿、雜草和栽培植物中檢測(cè)到苜?；ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)以及菜豆卷葉病毒[11]；在伊朗苜蓿田中檢測(cè)到有苜?；ㄈ~病毒、菜豆卷葉病毒、花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)和菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV) 4種病毒可以侵染苜蓿，檢出率分別為23.3%、12%、0.7%和0.28%[12]；在甘肅張掖地區(qū)番茄花葉病毒(tomato mosaic virus, ToMV)和苜?；ㄈ~病毒復(fù)合侵染苜蓿[13]；在新疆有菜豆黃花葉病毒和苜?；ㄈ~病毒侵染苜蓿的報(bào)道[14-15]。新疆是我國(guó)苜蓿種植的主要產(chǎn)區(qū)之一[16]，近年來(lái)，牧草病害課題組成員在新疆苜蓿田間發(fā)現(xiàn)大量矮化、叢枝、卷葉等癥狀的植株，發(fā)病率為20%～100%，該病害不僅引起牧草大幅度減產(chǎn)，而且極大地縮短苜蓿草地使用年限。2017-2018年，借助Si-RNA高通量測(cè)序分析，認(rèn)為在此類(lèi)癥狀病株中可能攜帶有菜豆卷葉病毒。因此，本研究對(duì)栽培苜蓿疑似卷葉、矮化等癥狀的病害種類(lèi)的病原開(kāi)展BLRV分子檢測(cè)，以明確新疆苜蓿卷葉的癥狀是否由BLRV侵染引起，從而正確認(rèn)識(shí)該病害的病原種類(lèi)以及分類(lèi)地位，以便對(duì)該病害的防治提供理論依據(jù)[17]。

1 材料與方法

1.1 材料

待測(cè)苜蓿樣品的采集：2017年5月至2018年9月，分別在新疆北疆昌吉州的呼圖壁縣，烏魯木齊市的烏拉泊、板房溝、南山以及阿勒泰地區(qū)的布爾津、北屯、富蘊(yùn)縣采集表現(xiàn)為有卷葉、皺縮、矮化等癥狀的苜蓿病株樣品，同時(shí)將采集到的健康苜蓿植株作為陰性對(duì)照，每種癥狀的病葉樣品采集兩份，一份放入4 ℃短期保存，另一份樣品保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取等后續(xù)試驗(yàn)。

菌株和質(zhì)粒：Transl-T1感受態(tài)細(xì)胞，pEASYT1克隆載體均采購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室保存。

生化試劑：10×PCR Buffer (Mg2+)、dNTPs(2.5 mmol·L-1)、Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)、2 k bp DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)、cDNA第一鏈合成試劑盒、TRNzol Universal總RNA提取試劑、氨芐青霉素(Amp+)、X-gal、IPTG等生化試劑皆購(gòu)于北京全式金生化生物科技有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 苜蓿菜豆卷葉病毒的分子檢測(cè)

1.2.1 苜蓿總RNA的提取

分別稱(chēng)取0.1～0.2 g的苜蓿病樣和健康植株樣品的嫩葉，用TRNZOL universal (全式金)試劑法提取苜蓿葉片的總RNA (提取方法參見(jiàn)產(chǎn)品操作說(shuō)明書(shū))，并將提取的RNA置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菜豆卷葉病毒的RPCR擴(kuò)增及電泳檢測(cè)

將Trucco等[9]設(shè)計(jì)的BLRV的外殼蛋白基因特異性引物序列BLRV-F/BLRV-R提交至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：BLRV-F：5’-TAGGTTCCTTCGATTACAAG-3’，BLRV-R：5’-CTTCAATATTCGTCCAGTTC-3’。用全式金cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈，步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以合成的cDNA第一鏈為模板，BLRV-F/BLRV-R為引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。在25 μL的RT-PCR反應(yīng)體系中，cDNA模板1 μL；Taq DNA聚合酶 0.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL (2.5 mmol·L-1MgCl2)； dNT Ps 1 μL (10 mmol·L-1)；上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL；ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：94 ℃4 min，94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RT-PCR產(chǎn)物，使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄。

1.3 序列測(cè)定及分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，切取特異性目的條帶，采用快速凝膠回收純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收、純化后，再與載體Trans1-T1(TRANS)在常溫下連接25 min，繼而進(jìn)行轉(zhuǎn)化、涂板、藍(lán)白斑篩選，將篩選到的含正確插入片段的質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。運(yùn)用DNAMAN8.0軟件將測(cè)序獲得的序列與GenBank中已提交的菜豆卷葉病毒代表性序列進(jìn)行核苷酸序列同源性對(duì)比分析，使用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，最終將獲得的序列提交至Bankit獲得序列登錄號(hào)(MK263743.1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株癥狀

栽培苜蓿通常第1年不表現(xiàn)癥狀，第2年春季返青后即可表現(xiàn)癥狀，相對(duì)于健康苜蓿植株，疑似病毒病的苜蓿植株矮小，枝條細(xì)弱，葉片邊緣呈皺縮或有波紋的卷曲狀，常伴有花葉或黃化斑駁，發(fā)病嚴(yán)重的甚至無(wú)法開(kāi)花(圖1)。

圖1 苜蓿卷葉病毒病田間癥狀Figure 1 Symptoms of alfalfa leafroll virus disease in the field

2.2 RT-PCR檢測(cè)

對(duì)苜蓿病株樣品進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)，用引物BLRV-F/BLRV-R可以擴(kuò)增出大小約為1 000 bp的特異性條帶(圖2)。

圖2 BLRV RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 RT-PCR amplification of bean leafroll virus(BLRV)

2.3 BLRV外殼基因片段序列測(cè)定及分析

提取采集的疑似卷葉病毒病的苜蓿樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收純化、克隆和序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明：從新疆苜蓿疑似感染BLRV的樣品中得到長(zhǎng)955 bp的特異性片段，G+C含量為49.7%。經(jīng)序列比對(duì)，所得核苷酸序列與已報(bào)道的豆科植物上菜豆卷葉病毒(BLRV)分離物核苷酸序列同源性介于85.1%～96.5%。其中與阿根廷苜蓿BLRV分離物(KR261610.1)、美國(guó)豌豆BLRV分離物(HM439776.1)和(GQ404380.1)、澳大利亞苜蓿BLRV分離物(MF075256.1)序列同源性分別為96.5%、93.0%、92.7.%和89.2% (表1)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分析

運(yùn)用MEGA7.0軟件中鄰接法將新疆苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)外殼蛋白基因序列與GenBank中已報(bào)道的相同基因部分序列以及苜?；ㄈ~病毒[18](MF075254.1)、苜蓿矮化病毒[10](FJ15933.1)、苜蓿卷葉病毒[22](KX574859)外殼蛋白基因序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。經(jīng)序列比較分析，從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可見(jiàn)(圖3)，新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV-XJ分離物(MK263743)與希臘菜豆卷葉病毒(KT382814.1、HE601635.1、KT382812.1)分離物進(jìn)化樹(shù)關(guān)系最近，在同一進(jìn)化分支上，故將其鑒定為菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus)，同屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)黃癥病毒屬(Luteovirus)。

表1 新疆BLRV分離物外殼蛋白基因核苷酸序列與已報(bào)道BLRV分離物同源性比較Table 1 Comparison of the homology between the nucleotide sequence of the coat protein gene of bean leafroll virus (BLRV) isolates in Xinjiang and the reported BLRV isolates

圖3 用鄰接法構(gòu)建的新疆菜豆卷葉病毒紫花苜蓿分離物外殼蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the coat protein gene of the bean leafroll virus (BLRV)isolates on alfalfa in Xinjiang

3 討論與結(jié)論

截至2015年，我國(guó)苜蓿種植面積達(dá)到470.8萬(wàn)hm2[23]。新疆是我國(guó)苜蓿種植的主要產(chǎn)地之一，近幾年苜蓿病毒病的發(fā)生越發(fā)嚴(yán)重，但病原報(bào)道不多。本研究利用菜豆卷葉病毒(BLRV)特異性引物對(duì)新疆苜蓿疑似病毒病植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出長(zhǎng)955 bp特異條帶，測(cè)序序列比對(duì)結(jié)果與菜豆卷葉病毒(BLRV)同源性較高，與Trucco等[9]報(bào)道的阿根廷侵染苜蓿的BLRV(KR261610.)同源性最高。從構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可知，新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV(MK263743)與已知豆科植物中的菜豆卷葉病毒聚為一類(lèi)。該結(jié)果證明了新疆栽培苜蓿疑似卷葉病毒病的病原為菜豆卷葉病毒(BLRV)。阿根廷、伊朗、澳大利亞曾報(bào)道菜豆卷葉病毒侵染苜蓿[9,12,18]，本研究結(jié)果首次證實(shí)該病毒在中國(guó)侵染苜蓿，豐富了苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)在中國(guó)新疆地區(qū)基因組序列信息，對(duì)今后的檢測(cè)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

目前，國(guó)內(nèi)苜蓿種子供應(yīng)量還有所不足，苜蓿干草也是我國(guó)進(jìn)口草產(chǎn)品中的主打產(chǎn)品[24]。苜蓿種子和干草常常是病原的直接傳播來(lái)源，我國(guó)苜蓿種子進(jìn)口國(guó)家有美國(guó)、澳大利亞、西班牙和加拿大等[25]。文朝慧等[26]利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析結(jié)合RT-PCR方法從52份紫花苜蓿種子樣品中檢測(cè)到45份攜帶有苜?；ㄈ~病毒(AMV)、3份攜帶菜豆黃花葉病毒(BYMV)。苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)很可能隨著進(jìn)口苜蓿種子和苜蓿干草的引進(jìn)傳入我國(guó)并引起危害，相關(guān)部門(mén)應(yīng)引起足夠重視。

病毒是一類(lèi)傳染性很強(qiáng)的植物病原生物，通過(guò)對(duì)病毒病的檢測(cè)，可及早發(fā)現(xiàn)感病植物體內(nèi)病毒的存在，對(duì)病害的防治以及深入研究病毒的病理特點(diǎn)具有重要的意義。目前我國(guó)對(duì)苜蓿病毒病的研究較少，在今后的工作中還需要進(jìn)一步開(kāi)展檢測(cè)和防治技術(shù)研究。苜蓿病毒病對(duì)我國(guó)苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在較大的威脅，確認(rèn)不同病毒之間的聯(lián)系以及病毒復(fù)合侵染問(wèn)題還需要進(jìn)一步研究，為苜蓿病毒病害檢測(cè)及其防治奠定基礎(chǔ)。