王美寧，藺偉虎，馬碧花，李苗苗，田 沛

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

禾草內(nèi)生真菌是指在禾草體內(nèi)渡過全部或大部分生命周期但對禾草本身不顯示外部癥狀的一大類真菌[1-2]。廣泛研究的內(nèi)生真菌主要是子囊菌門(Ascomycota)麥角科(Clavicipitaceae)的有性世代Epichlo?和其所對應(yīng)的Neotyphdium屬內(nèi)生真菌，后統(tǒng)一命名為Epichlo?屬內(nèi)生真菌，Epichlo?內(nèi)生真菌廣泛存在于野大麥(Hordeum brevisubulatum)、黑麥草(Lolium perenne)、中華羊茅(Festuca sinensis)等禾草中[2-3]。禾草與內(nèi)生真菌能形成穩(wěn)定的共生體，宿主植物為內(nèi)生真菌提供生長所需的營養(yǎng)環(huán)境，內(nèi)生真菌寄生又能促進禾草地上與地下部分的生長，增加宿主植物生物量，提高其抗旱耐寒、耐鹽堿性、抗病蟲害等抗逆境脅迫能力以適應(yīng)生物及非生物脅迫[4-6]。高羊茅(Festuca arundinacea)和黑麥草感染內(nèi)生真菌被認(rèn)為能夠增加其對草食動物的抵抗力，增加抗旱、耐鹽等非生物脅迫能力，并且能夠提高宿主植物的競爭力[7-8]。中華羊茅是分布在我國青海、四川、甘肅等地的多年生叢生型禾本科羊茅屬植物，且絕大多數(shù)中華羊茅都帶有Epichlo?內(nèi)生真菌[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Epichlo?內(nèi)生真菌能協(xié)調(diào)中華羊茅在寒冷脅迫下的生理生化反應(yīng)，避免其受到凍傷[9]；在水分匱乏條件下，內(nèi)生真菌顯著提高了中華羊茅的株高分蘗等生長指標(biāo)，增加了抗旱性[10]；帶菌的中華羊茅與其他禾草混播，內(nèi)生真菌能增加中華羊茅的競爭力，促進伴生植物的生長，提高草地群落的穩(wěn)定性[11]。另有研究表明，中華羊茅內(nèi)生真菌共生體抗逆性與其產(chǎn)生的生物堿有關(guān)[12]。目前，對于中華羊茅內(nèi)生真菌共生體的研究主要集中在其抗寒、抗旱及生物堿上，對于其他方面的研究不足。

植物受到脅迫時，內(nèi)源激素含量會發(fā)生變化以應(yīng)對植物生長發(fā)育的需要，從而影響植物的生理過程，內(nèi)源激素是指由特定環(huán)境信號誘導(dǎo)植物細(xì)胞產(chǎn)生的能夠?qū)χ参锷矸磻?yīng)起到調(diào)節(jié)作用的活性物質(zhì)，對植物的生命代謝至關(guān)重要，是植物逆境顯示的信號。常見的植物內(nèi)源激素有生長素類(auxin)、赤霉素類(gibberellic acid)、細(xì)胞分裂素類(cytokinin)、脫落酸類(abscisic acid)及乙烯(ethylene)，它們對植物生長的影響復(fù)雜多樣，在細(xì)胞分裂與伸長、組織器官分化、成熟與衰老等方面，分別或相互協(xié)調(diào)地調(diào)控植物的生長、發(fā)育與分化[13]，在植物受到逆境脅迫時，植物內(nèi)源激素會發(fā)生改變以應(yīng)對環(huán)境脅迫[14]。

隨著全球工業(yè)的高速發(fā)展，重金屬污染已經(jīng)是一個嚴(yán)重影響植物生長以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境問題。Zn是植株生長發(fā)育過程中所需的營養(yǎng)元素，是谷氨酸脫氫酶的活化劑，缺Zn會改變植株的株型，影響植株的生長，但土壤中Zn的含量過高時就會對植物產(chǎn)生毒害作用，使植物新陳代謝紊亂，生長受阻，甚至導(dǎo)致死亡[15]；Cd是一種劇毒重金屬元素，對植物的光合作用、呼吸作用、酶活性以及營養(yǎng)元素的吸收均有影響，Cd會破壞膜系統(tǒng)，使胞內(nèi)物質(zhì)滲出，有毒物質(zhì)進入導(dǎo)致植株生理生化反應(yīng)紊亂[16-17]。內(nèi)生真菌與禾草共生，可顯著提高植物耐重金屬性[18-21]，禾草內(nèi)生真菌可用于重金屬污染的修復(fù)，且具有如下優(yōu)勢：一是內(nèi)生真菌伴隨植物生長，帶菌禾草表現(xiàn)出更強的生長力及抗逆性[1-4,22-23]。二是侵染了內(nèi)生真菌的植物可能對重金屬的積累更高；甚至在低濃度重金屬脅迫下，內(nèi)生真菌會促進宿主植物的生長[24-25]。鑒于此，感染內(nèi)生真菌的禾草有望應(yīng)用于重金屬污染的修復(fù)中。

中華羊茅為我國西北部重要的鄉(xiāng)土草，其帶菌率高，抗逆性強，對野外干旱、低溫及鹽堿脅迫等外界不良環(huán)境具有良好的適應(yīng)性，中華羊茅在土壤條件嚴(yán)苛的環(huán)境下也會生長，能在弱酸弱堿及營養(yǎng)不足的土壤條件下生長[1,26]，但對重金屬脅迫下中華羊茅-內(nèi)生真菌共生體的生長的研究尚未見報道。關(guān)于內(nèi)生真菌能提高禾草對重金屬抗性的研究較多，但關(guān)于重金屬脅迫下內(nèi)生真菌與寄主植物內(nèi)源激素的關(guān)系的研究較少，因此研究中華羊茅內(nèi)生真菌共生體對重金屬的抗性以及脅迫下植株內(nèi)源激素的變化有非常重要的意義。本研究以Epichlo?屬內(nèi)生真菌侵染(E+)和未侵染(E-)的中華羊茅為材料，在溫室環(huán)境下通過Zn和Cd處理，分析探究在重金屬處理下中華羊茅的生長與生理的變化，探究重金屬處理條件下內(nèi)生真菌與內(nèi)源激素含量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在青海省平安縣巴藏溝鄉(xiāng)(102°06′ E，36°20′ N，海拔3 129 m)中華羊茅植株上采獲種子，4 ℃保存于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院草地保護研究所冰箱。所用化學(xué)藥品均為分析純的ZnCl2和CdCl2，其中Cd2+的濃度100 mg·L-1，Zn2+的 濃度500 mg·L-1[27-31]。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2017年在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院智能溫室 (105°26′ E，35°36′ N，海拔1 718 m)開展。中華羊茅種子帶菌率檢測用苯胺藍(lán)染色法[32]，每株檢測20粒，確定種子帶菌率，建立內(nèi)生真菌侵染(E+)及未侵染(E-)種群。2017年8月將供試種子播種于育苗盤內(nèi)，待其生長2～3個分蘗后，對成熟分蘗的葉鞘進行內(nèi)生真菌帶菌率的檢測，確認(rèn)其帶菌率。將已建立的E+和E-種群于10月移栽至溫室內(nèi)。土壤采用黑土∶蛭石=3∶1的混合土，供試花盆規(guī)格為上徑15.5 cm×下徑11.5 cm×高14 cm的圓形花盆。在花盆中裝入等量滅菌完畢的冷卻土壤，移栽中華羊茅幼苗1株，選取長勢一致的中華羊茅幼苗，至幼苗生長1個月后，選分蘗數(shù)一致的15盆E+和15盆E-植株，對照組正常澆水，而Zn處理組與Cd處理組分別用100 mL 的 ZnCl2(500 mg·L-1)與 CdCl2(100 mg·L-1)溶液處理2次，隔14 d澆一次，處理28 d，每個處理5個重復(fù)，期間正常澆水(溫度：25±2 ℃，濕度：42±5%)。處理完畢后收獲植物材料用于以下指標(biāo)的測定。

1.3 指標(biāo)測定

測量中華羊茅單株株高、分蘗數(shù)，于烘箱中60 ℃/48 h烘干至恒重，后用電子天平(BSA224S-CW，Sartorius)分別測定地上和地下干物質(zhì)量。

中華羊茅植株內(nèi)源激素赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA)測定采用酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，由上海丹施生物科技有限公司提供。在植株處理28 d后，每盆取2 g中華羊茅葉片，用錫箔紙包裹液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆?。單株取樣?次重復(fù)，共3次重復(fù)。每盆取1 g中華羊茅葉片，加入9 mL PBS (pH 7.4)，用手工或勻漿器研磨勻漿，離心20 min(4 ℃，2 000 r·min-1)，按照試劑盒步驟提取后，用酶標(biāo)分析儀(Rayto RT-6100)在450 nm波長下測定樣品吸光度(OD值)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中植物內(nèi)源激素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本研究所有數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010錄入并作圖，各項指標(biāo)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行分析，不同離子處理采用單因素方差分析，對株高、分蘗和生物量，植株內(nèi)源激素赤霉素(GA3)、生長素(IAA)、細(xì)胞分裂素(CTK)和脫落酸(ABA)，進行LSD法檢測差異顯著性，Duncan法進行多重差異性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 重金屬Zn、Cd處理下內(nèi)生真菌對中華羊茅株高、分蘗和生物量的影響

Zn和Cd兩種不同處理均對中華羊茅的株高有影響。3種不同處理下，中華羊茅E+的株高均顯著大于E-的株高(P＜0.05)。與對照相比，Zn處理顯著增加了E+和E-的株高，Cd處理顯著降低了中華羊茅的株高 (P＜0.05) (圖1A)。

Zn和Cd兩種不同處理對中華羊茅的分蘗影響不同。6種不同處理下，中華羊茅E+的分蘗均顯著大于E-的分蘗(P＜0.05)。與對照相比，Zn處理對中華羊茅E+和E-分蘗的影響不顯著(P＞0.05)；Cd處理顯著增加了E+的分蘗且達(dá)到最大，E-植株分蘗顯著減少(P＜0.05)，說明內(nèi)生真菌能緩降Cd處理對中華羊茅分蘗降低的影響(圖1B)。

圖1 Zn、Cd處理下內(nèi)生真菌對中華羊茅的株高和分蘗的影響Figure 1 Effect of endophyte infection on plant height and the tiller of Festuca sinensis under Zn and Cd treatments

Zn和Cd兩種不同處理影響中華羊茅的地上與地下生物量。在Zn處理條件下，中華羊茅的地下生物量顯著大于對照和Cd處理；E+的地上生物量與對照和Cd處理差異不顯著(P＞0.05)，且E+和E-間差異不顯著。Cd處理降低了中華羊茅E+和E-的地上生物量和地下生物量；且E+的地上生物量顯著大于E-，而地下生物量E+與E-差異不顯著，說明內(nèi)生真菌顯著增加了Cd處理下中華羊茅的地上生物量(表1)。

表1 重金屬Zn、Cd處理下內(nèi)生真菌對中華羊茅生物量的影響Table 1 Effect of endophyte infection on aboveground and underground biomass of Festuca sinensis under Zn and Cd treatments

在Zn和Cd處理下內(nèi)生真菌對中華羊茅內(nèi)源激素GA3有顯著影響。對照組中，E+和E-的葉片中GA3無顯著差異(P＞0.05)。與對照相比，Zn處理顯著增加了中華羊茅E+和E-葉片中GA3含量，E+葉片中GA3含量增加39.8%，E-增加15.2%, E+顯著高于E-(P＜0.05)；Cd處理使中華羊茅GA3含量顯著下降(P＜0.05)，E+含量下降30%，E-含量下降 40%，E+含量顯著高于 E-(P＜0.05) (圖2A)。

中華羊茅E+和E-在Zn和Cd處理條件下內(nèi)源激素CTK的含量有顯著差異。對照組中，E+葉片中CTK顯著高于E-(P＜0.05)。與對照相比，Zn處理顯著增加了中華羊茅E+和E-葉片中CTK含量，E+含量增加35.8%，E-增加38.26%，E+顯著高于E-(P＜0.05)；Cd處理使中華羊茅CTK含量顯著下降(P＜0.05)，E+含量減少 56.5%，E-減少 55.4%(P＜0.05)，E+與E-差異不顯著(圖2B)。

中華羊茅E+和E-在Zn和Cd處理條件下內(nèi)源激素IAA含量差異顯著(P＜0.05)。對照組中，E+和E-葉片中的IAA含量無顯著差異(P＞0.05)。與對照相比，Zn處理顯著增加了中華羊茅E+葉片中IAA含量，E+的IAA含量增加了24.1%，E-的IAA含量雖然增加了但無顯著變化；對照相比，Cd處理下中華羊茅E+葉片的IAA含量與無顯著差異，E-植株顯著下降(P＜0.05)，其中E+減少6.7%，E-含量減少55%。在Zn和Cd處理下，E+葉片中的IAA含量均顯著高于E-(P＜0.05)(圖2C)。

中華羊茅E+和E-在Zn和Cd處理條件下ABA的含量有顯著差異。與對照相比，在Zn處理條件下，中華羊茅E+和E-葉片中的ABA含量顯著下降(P＜0.05)，其中E+下降47%，E-下降30%；Cd處理顯著增加了中華羊茅E+和E-葉片中的ABA含量(P＜0.05)，E+含量增加30.1%，E-增加14.4%。在3種不同處理下，中華羊茅E-的ABA含量均顯著高于 E+(P＜0.05)(圖2D)。

圖2 Zn、Cd處理下內(nèi)生真菌對中華羊茅內(nèi)源激素的影響Figure 2 Effect of endophyte infection on endogenous hormones in Festuca sinensis under Zn and Cd treatments

3 討論與結(jié)論

重金屬脅迫能引起植物一系列生理和生化變化[33]，比如干擾植物的光合作用，光電子傳遞的變化及礦質(zhì)營養(yǎng)吸收等[34]，植物對外界重金屬等非生物脅迫的抗性是復(fù)雜多樣的，其中與內(nèi)源激素含量的變化有直接關(guān)系[35]。植物內(nèi)源激素作為信號分子在重金屬脅迫、干旱脅迫等脅迫-感知-反應(yīng)一系列反應(yīng)中起作用，也可以介導(dǎo)植物對非生物脅迫的適應(yīng)反應(yīng)[36]。在逆境脅迫的條件下，植物內(nèi)源激素以含量的變化來應(yīng)對環(huán)境的改變[37]。Zn是植物生長所需的微量元素，適量的Zn可以促進植物的生長，但土壤中含量過高便會造成重金屬污染[38-39]，本研究發(fā)現(xiàn)，中華羊茅對Zn(500 mg·L-1)的抗性較強，Zn能顯著增加了中華羊茅的株高與生物量(P＜0.05)，這與前人研究發(fā)現(xiàn)Zn會促進植物生長的研究[40]一致。但促進的濃度存在差異，150和300 mg·L-1的Zn會抑制羽茅(Achnatherum sibiricum)的分蘗、葉片延伸，生物量也隨濃度的升高而下降，低濃度Zn種子萌發(fā)、植株生物量積累有促進作用，濃度過高則會出現(xiàn)抑制[19,27,41]，說明中華羊茅對Zn的抗性強，適宜在含有高濃度的Zn土壤中生長，這也是中華羊茅在治理重金屬Zn污染中的優(yōu)勢。有學(xué)者研究表明Zn是IAA形成的必需元素，Zn對IAA前體-色氨酸的合成有影響[42-43]，本研究發(fā)現(xiàn)Zn處理增加了中華羊茅葉片的生長類內(nèi)源激素GA3、IAA含量，降低了ABA含量，說明Zn與IAA的合成有關(guān)；GA3可以促進L-色氨酸轉(zhuǎn)換為D-色氨酸，進而被合成IAA[43]，因此，本研究說明Zn對中華羊茅體內(nèi)IAA與GA3的合成也有影響。

Cd作為眾多污染中對植物毒害最嚴(yán)重的重金屬之一，可以使植物一系列的生理代謝過程發(fā)生變化，包括光合作用、呼吸作用以及營養(yǎng)元素的吸收等，直接對植物生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的影響[44]。本研究發(fā)現(xiàn)100 mg·L-1的Cd會抑制中華羊茅的株高、減少生物量的積累，減少分蘗，Cd脅迫可以抑制醉馬草(Achnatherum inebrians)、披堿草(Elymus dahuricus)和野大麥幼苗胚芽的生長，表現(xiàn)出葉片黃化，胚根褐變，且生物量也隨Cd濃度的增加而下降[45-47]；Cd對高羊茅種子發(fā)芽與幼苗生長產(chǎn)生持續(xù)性抑制作用[27]，說明Cd對植物生長通常表現(xiàn)為抑制作用。Cd顯著降低了中華羊茅GA3、CTK的含量，Cd脅迫下水稻(Oryza sativa)葉片的內(nèi)源激素IAA、乙烯以及GA3含量下降[28]，說明Cd脅迫會使植株體內(nèi)生長類激素的含量下降。Cd顯著增加了中華羊茅葉片中脅迫激素ABA的含量(P＜0.05)，說明植物生長過程中能通過提高ABA的含量，緩解重金屬Cd的毒害。

不論在正常生長或是在脅迫條件下，內(nèi)生真菌均能促進禾草的生長發(fā)育，內(nèi)生真菌能提高寄主植物對外界環(huán)境中重金屬的耐受性。本研究中，內(nèi)生真菌提高了重金屬脅迫下中華羊茅的株高、分蘗和地上、地下生物量，且顯著提高了中華羊茅在Cd處理下的分蘗數(shù)；內(nèi)生真菌不但提高了多年生黑麥草對Zn的耐受性，增加了地上生物量[48]；還提高了紫羊茅(Festuca rubra)、細(xì)羊茅(Festuca stapfil)在Cu脅迫下生物量的積累；Cd脅迫會降低高羊茅和草地羊茅(Festuca pratensis)的生物量，而內(nèi)生真菌可以緩解Cd對羊茅屬植物的毒害作用[19]，這均說明內(nèi)生真菌能提高了植株對重金屬的抗性，緩沖重金屬對植株的毒害作用。在脅迫條件下，內(nèi)生真菌改變植物內(nèi)源激素含量使植物適應(yīng)逆境脅迫[28]。本研究中，內(nèi)生真菌通過增加3類生長類激素含量、降低了抑制類激素含量ABA，促進了中華羊茅在重金屬處理下的生長，提高了對重金屬的抗性，吳慧鳳[49]研究發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛(Dendrobiuyn catenatum)接種內(nèi)生真菌后植株的GA3含量達(dá)到極顯著水平，菌株C20、C35、C42極顯著地提高IAA的含量，而ABA的含量均極顯著地低于未接菌植株；梅映學(xué)[28]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下帶菌水稻的IAA、乙烯、GA3均顯著高于未帶菌水稻，均說明重金屬脅迫時，內(nèi)生真菌能協(xié)調(diào)植物激素以改變植物的生長。

本研究結(jié)果說明內(nèi)生真菌能通過調(diào)控植物內(nèi)源激素的含量，提高寄主植物對非生物脅迫的適應(yīng)性，目前對于內(nèi)生真菌通過調(diào)控宿主植物內(nèi)源激素的研究較多，但在機理方面相關(guān)研究較少，對于其分子水平的研究匱乏，在未來的研究中應(yīng)大量開展該方面的研究，以期闡明內(nèi)生真菌-重金屬脅迫-植物三者相互作用關(guān)系，為內(nèi)生真菌抗逆研究提供科學(xué)依據(jù)。