劉明 何攀 陳渠玲 謝婷婷 聶蓬勃 閆冬閣

摘要：目的：建立液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)法測(cè)定馬來(lái)酸桂哌齊特中雜質(zhì)（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的檢測(cè)方法。該方法專屬性強(qiáng)、檢測(cè)限低、穩(wěn)定性好，回收率高可用于馬來(lái)酸桂哌齊特生產(chǎn)過(guò)程中雜質(zhì)（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：馬來(lái)酸桂哌齊特;（E）-3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯;（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用

【中圖分類號(hào)】R314 ???【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A ???【文章編號(hào)】2107-2306（2019）04-247-02

馬來(lái)酸桂哌齊特化學(xué)名稱為（E）1-[（吡咯烷羰基）甲基]-4-（3，4，5-三甲氧基肉桂?；┻哙喉樁∠┒猁}，商品名為克林澳，為哌嗪類鈣離子拮抗劑^?[1]，具有多種藥理作用，如腺苷增效作用^[2]、擴(kuò)血管作用^?[3]、改善血液流變學(xué)，廣泛用于治療腦血管疾病，1970年由法國(guó)Sanofi-Anentis公司最先生產(chǎn)，并在歐洲、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家廣泛應(yīng)用，2002年在中國(guó)上市^[1]。

1 儀器與試劑

1.1儀器

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1290-6460，帶電噴霧離子源，配Agilent Poroshell 120 EC-C18（100×2.1 mm，2.7μm）色譜柱，畢克氮?dú)獍l(fā)生器。

1.2試劑

甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）;甲酸（色譜純，國(guó)藥集團(tuán)）;乙二胺（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）;超純水（18.25MΩ×cm，中沃水務(wù)）;對(duì)照品（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯（純度≥99%，谷川醫(yī)藥科技（湖南）有限公司提供）;對(duì)照品（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺（純度≥99%，谷川醫(yī)藥科技（湖南）有限公司提供）;樣品批號(hào)（20170901，20170902，2017090，谷川醫(yī)藥科技（湖南）有限公司提供）。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)條件

2.1.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-0.1%甲酸（V/V，50：50），運(yùn)行時(shí)間：7min;色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（100×2.1 mm，2.7μm）流速：0.4ml/min;柱溫：35℃;進(jìn)樣體積：5μl。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源ESI;檢測(cè)方式：正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式;霧化器壓力：15psi;離子噴霧電壓：4000V;干燥器溫度：300℃;干燥器流速：11 L/min;

2.2 ?溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液 ?。‥）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺10mg，用二氯甲烷溶解定容至10mL作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為1000ng/mL，準(zhǔn)確移取對(duì)照品儲(chǔ)備液用二氯甲烷稀釋制成每1mL中含0.005μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取100mg樣品于10ml棕色容量瓶中，加5ml二氯甲烷旋渦混勻1min，加0.5ml二乙胺，超聲反應(yīng)30min，用二氯甲烷定容至10ml。

2.2.3 3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯溶液：取稱定3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯適量，精密稱定，加二氯甲烷溶解并定量稀釋制成每1ml中含1000μg的溶液。

2.3 ?系統(tǒng)適用性

分別取溶劑空白、對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)試，其中空白進(jìn)樣1次，對(duì)照溶液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖的保留時(shí)間、峰面積，并計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示，空白溶液無(wú)干擾峰，計(jì)算峰面積的RSD為1.10%，色譜峰型對(duì)稱，表明該方法系統(tǒng)適用性較好。

2.4 ?專屬性

分別取空白溶劑、對(duì)照品溶液、供測(cè)試品溶液進(jìn)樣測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在目標(biāo)物和供測(cè)試樣品出峰處空白溶劑沒(méi)有色譜峰，表明該方法專屬性良好。

2.5 ?檢測(cè)限

取對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋進(jìn)樣分析，稀釋至信噪比S/N=3的濃度為檢測(cè)限濃度。（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺檢測(cè)限濃度為0.2ng/ml，折算成（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯為0.0153mg/kg。而該雜質(zhì)的限量為1.38mg/kg，檢測(cè)限完全滿足質(zhì)量控制的要求。

2.6 ?溶液穩(wěn)定性考察

取對(duì)照品溶液、供試品溶液分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)，8小時(shí)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣一次，記錄對(duì)照品溶液和供試品溶液中（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺的保留時(shí)間、峰面積;計(jì)算平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2.7 ?線性關(guān)系考察

分別取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用二氯甲烷稀釋成對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度依次為1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL，分別進(jìn)樣，以對(duì)照濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），峰面積為縱坐標(biāo)（Y，峰面積），繪制線性回歸曲線，其方程式為：Y = 397.942351X + 24.963974，相關(guān)系數(shù)R=0.9997。結(jié)果表明目標(biāo)物在質(zhì)量濃度范圍1ng/mL～50ng/mL內(nèi)有很好的線性關(guān)系。

2.8 樣品測(cè)試

取3個(gè)批次的馬來(lái)酸桂哌齊特的樣品進(jìn)行測(cè)試，記錄峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的殘留量，結(jié)果分別為0.039mg/kg、0.045mg/kg、0.054mg/kg。

3 討論

3.1 分析方法的選擇

（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯能與正相色譜固定相，流動(dòng)相中的醇或水發(fā)生反應(yīng)，因此不能直接用色譜法進(jìn)行分析，要先進(jìn)行衍生化反應(yīng)生成穩(wěn)定的化合物才能進(jìn)行色譜分析，利用（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯與二乙胺反應(yīng)定量生成（E）N，N-二甲基-3，4，5-三甲氧基肉桂酰胺的原理，對(duì)衍生化后的生成物進(jìn)行色譜分析。

3.2 衍生條件的選擇

本文作者在前人研究的基礎(chǔ)上對(duì)衍生反應(yīng)進(jìn)行了驗(yàn)證，添加10μg（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯于樣品中，對(duì)衍生劑二乙胺的添加量和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在二乙胺加入量為0.50mL，超聲反應(yīng)時(shí)間為30min的時(shí)候反應(yīng)最完全，轉(zhuǎn)化率能達(dá)到99.7%。

3.3 溶劑的選擇

由于（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯反應(yīng)活性很強(qiáng)，能與水和醇類物質(zhì)反生反應(yīng)，所以不能使用流動(dòng)相作為溶劑，本文在選擇溶劑的時(shí)候發(fā)現(xiàn)（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯及其衍生物均能在二氯甲烷中能穩(wěn)定存在，并且在二氯甲烷中溶解度大，二氯甲烷在以甲醇和甲酸水溶液作為流動(dòng)相的體系中不產(chǎn)生溶劑效應(yīng)且空白無(wú)干擾信號(hào)，故本文在配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品處理的時(shí)候均選擇了二氯甲烷作為溶劑。

3.4限量規(guī)定的討論

參照歐洲藥品管理局（EMA）、美國(guó)食品藥品管理局（FDA）及人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）頒布的基因毒性雜質(zhì)控制的指導(dǎo)文件，推薦以毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC，1.5?μg/天）來(lái)控制用藥風(fēng)險(xiǎn)。以馬來(lái)酸桂哌齊特日劑量320?mg/天計(jì)算，（E）3，4，5-三甲氧基肉桂酰氯的限度?=1.5ug/天/320mg/天=4.6mg/kg，EMA關(guān)于基因毒性雜質(zhì)限度指南的問(wèn)答中同時(shí)指出，如果在最后一步合成前，實(shí)際生成或引入了一個(gè)（潛在）基因毒性雜質(zhì)，可以不將其納入原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，但是必須保證該雜質(zhì)在合成中間體中有合理的控制限度并且在原料藥檢測(cè)結(jié)果中明確其含量不超過(guò)來(lái)源于TTC或其他認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)的30%，即4.6mg/kg×30%=1.38mg/kg，3批次樣品測(cè)試結(jié)果均滿足安全限量。

參考文獻(xiàn)

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[2] 耿洪業(yè)， 王少華. 實(shí)用藥物治療學(xué). 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2006： 1060-1061

[3] 馮怡墨， 孫曉川， 張曉冬，等. 依達(dá)拉奉聯(lián)合馬來(lái)酸桂哌齊特治療動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的臨床觀察[J]. 中國(guó)藥房， 2017， 28（2）：230-232