陳 瑩 Cheong LingZhi 趙家和 陳潔妙 乙叢敏 叢艷霞 李 曄 蘆晨陽 周 君 蘇秀榕

(寧波大學食品與藥學學院1，寧波 315800)(中國農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所2，武漢 430062)

金槍魚主要以生魚片、壽司、罐裝食品等方式被消費，未被利用的副產(chǎn)物高達35%～40%，金槍魚油則是其中主要的副產(chǎn)物之一，如何對其進行有效的綜合利用是當前亟待解決的重要問題之一[1-3]。研究發(fā)現(xiàn)，金槍魚油中含有一定量的ω-3系列脂肪酸——二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid, C22H32O2，DHA) ， DHA作為細胞膜形成的主要成分，在嬰幼兒的大腦和視力發(fā)育方面有著重要影響[4-8]。懷孕期間ω-3脂肪酸的缺乏與嬰兒的視覺和行為缺陷有關(guān)，這些缺陷無法通過產(chǎn)后補充來逆轉(zhuǎn)[4]。除此之外，ω-3脂肪酸還可以幫助降低早產(chǎn)率和或增加妊娠期[9-11]；在抗炎、提高機體免疫功能、抑制癌癥的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)移方面也具有明顯的效果[12, 13]。

雖然人體中能夠通過α-亞麻酸合成DHA，但是合成速度緩慢，因此需要從食物中額外補充[4]。與游離脂肪酸和乙酯形式相比，?；视突蛄字问降纳攀矰HA不僅在氧化穩(wěn)定性方面表現(xiàn)更加優(yōu)異，也更加有利于人體內(nèi)的消化吸收[14, 15]。然而，由于酰基甘油形式的天然金槍魚油中DHA的含量僅20%左右[16]，難以滿足人們的需要，因此，選擇一種合適的方法富集金槍魚油中的DHA將具有重要意義。脂肪酶選擇性催化水解富集?；视托问降腄HA在實驗和企業(yè)生產(chǎn)過程中都取得了不錯的效果，這是由于ω-3多不飽和脂肪酸中的順式雙鍵的空間位阻和彎曲，使甲基基團接近酯鍵，脂肪酶不能進入和水解ω-3多不飽和脂肪酸的酯鍵[17]，在水解過程中產(chǎn)生的游離飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸可以通過皂化或分子蒸餾除去，從而產(chǎn)生富含ω-3 PUFA的酰基甘油餾分(包括甘油一酯，甘油二酯，甘油三酯)。酶法提取與傳統(tǒng)方法如分子蒸餾、尿素包合法等相比具有多種優(yōu)點，主要體現(xiàn)在酶催化反應條件溫和，降低了DHA聚合、氧化等風險[18-25]；對底物選擇性高，減少了能源消耗，是一種重要的綠色可持續(xù)的富集方法[20, 21]。目前，脂肪酶水解富集ω-3脂肪酸也面臨一些瓶頸，主要包括反應時間較長(>24 h)，富集水平(<40%)和?；视彤a(chǎn)率較低(<50%)[26, 27]。例如，Mbatia等人[26]使用Thermomyceslanuginosus脂肪酶反應24 h，僅將尼羅河鱸魚內(nèi)臟油中的EPA和DHA濃度從12%提高到35%。因此，在尋找高選擇性脂肪酶，優(yōu)化和改造水解過程以獲得高產(chǎn)率的富含ω-3 PUFA的?；视图壏址矫?，需要做更多的工作。

本研究利用皺褶假絲酵母脂肪酶選擇性水解法提高金槍魚油中DHA的含量，皺褶假絲酵母脂肪酶富集DHA的能力主要歸因于脂肪酸選擇性，據(jù)報道，皺褶假絲酵母脂肪酶由用于識別底物鏈的L形隧道組成，該隧道非常適合油酸的空間要求，由于這個原因，皺褶假絲酵母脂肪酶對于廣泛的脂肪酸鏈長度是非特異性的，但對長鏈多不飽和脂肪酸呈現(xiàn)低活性[28]。這保證了皺褶假絲酵母脂肪酶能夠有效富集?；视椭械腄HA。通過系統(tǒng)研究水解反應條件(水油質(zhì)量比、脂肪酶添加量、水解溫度和時間)，獲得富集DHA甘油酯的最優(yōu)工藝，為實現(xiàn)DHA甘油酯產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚油；皺褶假絲酵母脂肪酶；37種脂肪酸甲酯混標；GF254薄層色譜硅膠；甲醇(95%)、乙醇、甲醇、氯仿、氫氧化鉀、酚酞、一水硫酸氫鈉、乙醚、正己烷、甲酸、碘均為分析純或色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

RO15多點磁力攪拌器；3A-401WP24恒溫水浴鍋；TDL5M離心機；EL204電子天平；Agilent7890A氣相色譜儀；M7-80EI質(zhì)譜儀。

1.3 方法

1.3.1 DHA甘油酯富集工藝

皺褶假絲酵母脂肪酶促魚油水解→水解產(chǎn)物皂化脫酸→薄層層析定性分析→酸價測定→DHA含量測定

1.3.1.1 皺褶假絲酵母脂肪酶水解反應

按照水油質(zhì)量比例(2∶1、1∶2、1∶7、1∶15、1∶47)稱取一定量魚油置入50 mL錐形瓶中，稱取一定量皺褶假絲酵母脂肪酶(1%、3%、5%、7%)溶解在去離子水中，再將酶液轉(zhuǎn)移入錐形瓶(水油總質(zhì)量20 g)，充分混合均勻。將上述錐形瓶密封，置于一定溫度(30、40、50、60 ℃)的恒溫多點磁力攪拌器(轉(zhuǎn)速300 r/min)反應一定的時間(0.5、1、2、4、6、10 h)。反應結(jié)束后，將上述混合溶液95 ℃水浴10 min使脂肪酶滅活,然后在4 000 r/min條件下離心10 min,分離油相和水相。

1.3.1.2 水解產(chǎn)物皂化脫酸

根據(jù)前人方法進行皂化過程以除去水解的游離脂肪酸[29]。取200 μL酶解后的油樣，加入2 mL去離子水、2 mL無水乙醇(溶解油樣，加速皂化過程)，1 mL 0.5 mol/L的氫氧化鉀-乙醇(皂化以除去游離脂肪酸)，混合均勻完成對油樣的脫酸皂化。然后用正己烷萃取溶液中的甘油酯成分。簡而言之，向上述溶液中加入4 mL正己烷混合均勻，在3 000r/min條件下離心10 min。離心后，上層為含有甘油酯成分的正己烷，下層為脂肪酸鉀、乙醇等皂化液。取上清液至離心管中備用，下層再加入4 mL正己烷用相同方式萃取一次，合并兩次萃取得到的含有甘油酯的正己烷溶液。將上述正己烷溶液氮吹至恒重則得到富含DHA甘油酯的油樣。

1.3.1.3 薄層層析定性分析

取25 μL氮吹后的油樣溶解到100 μL的氯仿-甲醇(2∶1)中，用點樣器點樣于薄層板上，一般為圓點，點樣基線距底邊2.0 cm。在層析缸中加入展開劑，展開劑為乙醚-正己烷-甲酸(60∶40∶1)。將載有樣品的薄層板置入層析缸中，上行展開，自然晾干后，置碘蒸氣中顯色至斑點完全顯現(xiàn)。最后根據(jù)薄層層析結(jié)果判斷水解下來的脂肪酸和甘油酯是否分離。

1.3.1.4 酸價測定

參照GB 5009.229—2016《食品中酸價的測定》[30]進行水解產(chǎn)物酸價的測定。將含有0.5 mL酚酞指示劑的50 mL乙醇溶液置入錐形瓶中，用0.1 mol/L的氫氧化鉀溶液滴定至溶液變色，并保持溶液15 s不褪色，即為終點。然后將中和后的乙醇溶液轉(zhuǎn)移至裝有一定量魚油樣品的錐形瓶中，充分混勻。用氫氧化鉀標準溶液滴定，滴定過程中要充分搖動。至溶液顏色發(fā)生變化，并且保持15 s不褪色，即為滴定終點[25]。酸價計算公式：

X=C×(V-V0)×56.11/m

式中：X為試樣的酸價(以氫氧化鉀計/mg/g)；V為試樣消耗氫氧化鉀標準溶液的體積/mL；C為氫氧化鉀標準溶液的實際濃度/mol/L；V0為乙醇消耗氫氧化鉀標準溶液的體積/mL；m為試樣質(zhì)量/g；56.11為氫氧化鉀的摩爾質(zhì)量/g/mol。

1.3.1.5 DHA含量測定

將金槍魚油甘油酯部分的脂肪酸甲基化并根據(jù)AOCS方法Ce-1c 89進行分析[31]。簡而言之，將100 mg油溶解在4 mL正己烷中，通過向油溶液中加入200 μL 0.5 mol/L氫氧化鈉甲醇溶液進行甲基化，然后將混合物在室溫下攪拌2 min。最后，將上層有機層通過無水硫酸鈉柱過濾并回收到GC小瓶中，用正己烷稀釋10倍后進行分析。

色譜柱：DB-WAX聚乙二醇氣相毛細柱(60.0 m×250 μm×0.25 μm)，升溫程序：50 ℃保持1 min后，以25 ℃/min升至200 ℃，以3 ℃/min升至230 ℃保持15 min，再以3 ℃/min升至250 ℃；載氣(He)流速 1.0 mL/min，壓力 10 kPa，進樣量1 μL；不分流模式。

1.3.1.6 甘油酯(包括甘油一酯，甘油二酯和甘油三酯)得率計算

1.3.2 實驗設(shè)計1.3.2.1 單因素實驗

以DHA富集和甘油酯得率為指標，分別選取不同水解參數(shù)進行研究，確定最適水油質(zhì)量比、脂肪酶添加量、反應溫度和反應時間。

1.3.2.2 響應面實驗

在響應面實驗的基礎(chǔ)上，選取水油質(zhì)量比、脂肪酶添加量、反應溫度和反應時間4個因素為自變量，以DHA、ω-3含量和甘油酯得率為響應值，根據(jù)box-behnken進行響應面分析實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 金槍魚油脂肪酸組成

金槍魚油脂肪酸組成見表1，金槍魚油中含有36.43%的飽和脂肪酸，24.63%的單不飽和脂肪酸以及38.94%的多不飽和脂肪酸。ω-3脂肪酸占比為30.70%，其中包括24.59%的DHA，5.6%的EPA以及少量的α-亞麻酸(0.51%)；相比于較高含量的ω-3脂肪酸，金槍魚油中的ω-6脂肪酸含量較低，只有3.09%；在飽和脂肪酸中，十六烷酸的含量最高(22.81%)，其次是十四烷酸(3.95%)；單不飽和脂肪酸中十八碳烯酸和十六碳烯酸的含量最高，分別達到15.49%和7.34%。

表1 金槍魚油脂肪酸組成

2.2 脂肪酶水解條件單因素實驗

以DHA、ω-3含量和甘油酯得率為指標，分別選取不同水解參數(shù)進行研究，確定最適水∶油比、脂肪酶添加量、反應溫度和反應時間。

2.2.1 水油質(zhì)量比對DHA、ω-3含量和甘油酯得率的影響

固定反應溫度為40 ℃，脂肪酶:魚油比3%，水解時間為4 h，其他條件保持不變，控制水∶油比2∶1、1∶2、1∶7、1∶15和1∶47，比較水∶油比對富集效果的影響。水油質(zhì)量比例對富集效果的影響如圖1所示，在水∶油比1∶2時， DHA和ω-3含量最高，分別為40.26%和46.84%。DHA和ω-3的含量隨著水油質(zhì)量比例的增大而增大，水油質(zhì)量比達到1∶2后，甘油酯得率隨著水油質(zhì)量比例的增大而減小，水∶油比為1∶7時，水解反應達到動態(tài)平衡。綜合考慮甘油酯中DHA的富集量和甘油酯得率，選取1∶7為最優(yōu)水油質(zhì)量比例。

圖1 水油質(zhì)量比例對富集效果的影響

2.2.2 脂肪酶添加量對DHA、ω-3含量和甘油酯得率的影響

脂肪酶添加量對富集效果的影響如圖2所示，脂肪酶的添加量對DHA和ω-3的富集量沒有顯著性的影響。當酶添加量由魚油質(zhì)量的1%增加到5%時，甘油酯中的DHA和ω-3質(zhì)量分數(shù)分別保持在38%～40%和44%～46%。此外，甘油酯得率也不隨脂肪酶的添加量變化而趨于58%～60%，加酶量為5%時略有上升趨勢。結(jié)果表明，脂肪酶的添加量在魚油質(zhì)量的1%～5%范圍，酶量足夠，底物達到飽和，因此DHA、ω-3含量和甘油酯得率無明顯變化。當酶量超過5%時，DHA和ω-3含量呈現(xiàn)下降趨勢，得率呈現(xiàn)上升狀態(tài)。反應體系中加入較高的酶會導致反應混合物的不當混合，從而促進傳質(zhì)的限制。從成本角度出發(fā)考慮，脂肪酶價格昂貴，因此本試驗選取1%魚油質(zhì)量為最優(yōu)加酶量。

圖2 脂肪酶添加量對富集效果的影響

2.2.3 溫度對DHA、ω-3含量和甘油酯得率的影響

DHA和ω-3含量在水解溫度為40 ℃時達到最高，分別為39.62%和45.93%。DHA和ω-3含量隨著溫度的升高而升高，達到40 ℃后，DHA和ω-3含量隨著溫度的升高而減少，溫度達到60℃時，DHA和ω-3的質(zhì)量分數(shù)分別減少至34.36%和42.17%。得率在30%～50 ℃趨于58%～60%，50 ℃之后隨著溫度的升高而增大，60 ℃時得率達到66.79%。這與酶的性質(zhì)有關(guān)。低溫抑制酶的活性，酶催化作用受到限制，水解能力減弱，使得水解反應不足以充分進行，進而導致DHA和ω-3含量偏低。在脂肪酶的最適溫度效應達到最高，水解能力達到最強。隨著溫度的繼續(xù)升高，酶的活性受到限制，水解能力減弱，酸價降低，得率增高。因此選擇40 ℃為最佳水解溫度。溫度對富集效果的影響如圖3所示。

圖3 溫度對富集效果的影響

2.2.4 水解時間對DHA、ω-3含量和甘油酯得率的影響

水解時間對富集效果的影響如圖4所示，在水油質(zhì)量比例、脂肪酶添加量和溫度一定的條件下，DHA和ω-3含量無明顯變化，結(jié)果表明水解時間對結(jié)果影響不大，皺褶假絲酵母脂肪酶能夠在較短時間內(nèi)迅速水解脂肪酸組分，延長水解時間對富集效果無太大貢獻。由圖可知，水解4 h獲得的DHA和ω-3含量稍高，因此選取4 h為最佳水解時間。

圖4 水解時間對富集效果的影響

2.3 Box-Behnken響應面實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，使用design expert8.0.6軟件對響應面實驗進行設(shè)計，對水油質(zhì)量比例、脂肪酶添加量、溫度和水解時間進行優(yōu)化，以甘油酯中DHA含量及甘油酯得率為響應值，設(shè)計四因素三水平響應面實驗，得出最優(yōu)水解條件并進行驗證分析。金槍魚油中DHA甘油酯的制備響應面實驗因素水平表見表2。Box-Behnken設(shè)計及實驗結(jié)果見表3。

表2 金槍魚油中DHA甘油酯的制備響應面實驗因素水平表

表3 Box-Behnken設(shè)計及實驗結(jié)果

DHA回歸模型方差分析表見表4，DHA含量=-4.61+1.27A+1.11C+14.90D-0.01A2-0.09C2-5.04D2。DHA回歸模型的P值小于0.000 1， DHA模型影響顯著，說明不同條件下所制備的富含DHA的甘油酯差異顯著。失擬項P值為0.352 7，遠大于0.05，失擬項不顯著，說明實驗得到的DHA模型選擇合適。各因素對實驗的影響主次順序為D>D2>A2>C2>A>C，顯然對DHA含量影響最大的是水油質(zhì)量比例，其次是溫度，最后是時間。水油質(zhì)量比例對結(jié)果的影響高度顯著(P<0.000 1)。P值大于0.05，溫度和水解時間對DHA含量影響不顯著，這與其他研究有所不同。溫度和水解時間對模型影響不顯著，但為維護模型的層次結(jié)構(gòu)不予以消除。

表4 DHA回歸模型的方差分析表

注：R2=0.883 2; AdjustedR2=0.851 3。

水油質(zhì)量比例與溫度及水解時間的交互作用對DHA含量的影響的響應面圖如圖5-6所示。由圖5可知，當溫度、水解時間和加酶量為定值時，DHA含量隨著水油比的增高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢。最優(yōu)水油比落在0.81～1.21之間，水油比在0.81之前，DHA含量隨著水油比的增高而增加，水油比在1.21之后，DHA含量隨著水油比的增高而呈下降趨勢。這主要受兩方面影響，第一，酯水解過程可逆，水過少或過多都不利于反應向水解方向進行。第二，脂肪酶作用于油水兩相形成的微乳液，水過少時不能形成微乳液；水過多導致油水兩相形成的微乳液分層，脂肪酶作用的界面減小。由圖6可知，溫度的最優(yōu)范圍在42～48 ℃之間，且隨著溫度的升高，DHA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是因為酶有最適溫度，溫度過低或過高都會使酶活性減弱，不利于反應的進行。

圖5 水油質(zhì)量比例和時間對富集DHA的影響響應面圖

圖6 水油質(zhì)量比例和溫度對富集DHA的影響響應面圖

得率回歸模型方差分析表見表5，甘油酯得率=118.12-0.09A-2.98B-8.02C-47.83D+0.06AC+0.30BC+0.22C2+15.63D2。得率回歸模型的P值小于0.000 1， DHA模型影響顯著，說明不同條件下制備的富含DHA的甘油酯型魚油得率差異顯著。得率回歸模型的失擬項P值為0.059 6，略大于0.05，這表明了得率模型的失擬項不顯著，說明實驗得到的得率模型選擇合適。表5結(jié)果顯示，各因素對實驗的影響主次順序為C>D>D2>B>C2>A>AC>BC，顯然對得率影響最大的是水解時間，其次是水油質(zhì)量比例，最后是脂肪酶添加量和溫度。四個自變量因素水解時間(P<0.000 1)，水油質(zhì)量比例(P<0.000 1)，脂肪酶添加量(P<0.05)，溫度(P<0.05)對甘油酯得率有顯著性的影響。其中水解時間和水油質(zhì)量比為高度顯著項。顯著因素交互作用的P值均大于0.05，表明各因素的交互作用對得率影響均不顯著。

表5 得率回歸模型的方差分析表

注：R2=0.942 5; AdjustedR2=0.919 4。

2.4 最優(yōu)水解條件確定與驗證

經(jīng)過design expert軟件分析，綜合考慮選出的理論最優(yōu)水解條件為：溫度50 ℃、水解時間3 h、脂肪酶添加量為魚油質(zhì)量的1%和水油質(zhì)量比例為1∶1.7，采用公式擬合得到的預測值為DHA質(zhì)量分數(shù)35.55%、ω-3質(zhì)量分數(shù)42.25%、得率73.85%。經(jīng)過兩次平行實驗驗證，實測值為 DHA含量36.58%，ω-3質(zhì)量分數(shù)44.68%，得率63.78%，實測值和預測理論值接近，表明模型準確。

3 結(jié)論

3.1 單因素實驗結(jié)果顯示，水油質(zhì)量比例對酶促反應具有明顯影響，水油質(zhì)量比例為1∶2時，富集得到的DHA和ω-3含量均最高；脂肪酶添加量為魚油質(zhì)量的1%～5%時，DHA含量、ω-3含量和得率三者都保持穩(wěn)定；40 ℃時富集效果最佳；DHA和ω-3含量隨著水解時間的增加略有增加，得率隨水解時間的增加略有下降，變化幅度不大，延長水解時間對增大反應程度無太大作用。

3.2 響應面實驗表明，各影響因素交互作用均不顯著，最優(yōu)水解條件為水油質(zhì)量比例1∶1.7、脂肪酶添加量為魚油質(zhì)量的1%、溫度50 ℃和水解時間3 h，在此條件下得到的預測值為：DHA質(zhì)量分數(shù)為35.55%、ω-3質(zhì)量分數(shù)為42.25%、得率73.85%。實測值：DHA質(zhì)量分數(shù)為36.58%，ω-3質(zhì)量分數(shù)為44.68%、得率63.78%，與理論預測結(jié)果接近。因此模型可以預測DHA、ω-3含量和甘油酯得率。