孫達權?石靜?石松?薛殿婷?徐瑩瑩

【摘要】目的 克隆樁蛋白基因（PXN）的蛋白編碼區(qū)并構建PXN基因真核表達載體，建立PXN穩(wěn)轉肝癌細胞株，分析PXN基因對肝癌細胞的作用。方法 Trizol法提取肝癌細胞總RNA并逆轉錄成cDNA，PCR法擴增PXN基因蛋白編碼區(qū)并構建真核表達質粒pEBFP-PXN。脂質體法轉染肝癌細胞Hep G2，G418篩選培養(yǎng)獲得樁蛋白高表達穩(wěn)轉肝癌細胞株。實時無標記細胞分析檢測細胞生長速率，細胞創(chuàng)傷-愈合實驗分析細胞遷移速率。蛋白免疫印跡法檢測細胞內(nèi)蛋白表達變化。結果 成功克隆PXN基因并構建真核表達載體pEBFP-PXN。獲得樁蛋白高表達單克隆穩(wěn)轉肝癌細胞株，胞內(nèi)顯示藍色熒光，蛋白免疫印跡法顯示穩(wěn)轉株內(nèi)表達外源融合蛋白BFP-PXN。樁蛋白表達不影響Hep G2肝癌細胞的生長速率但可以抑制其細胞遷移，穩(wěn)轉細胞上皮標志蛋白E-Cadherin表達升高、間質標志物N-Cadherin和Vimentin表達下降。結論 PXN基因不影響Hep G2肝癌細胞生長增殖速率但可以抑制其細胞遷移，這可能與其可以影響肝癌細胞上皮-間質轉化標志蛋白表達有關。

【關鍵詞】肝癌細胞;樁蛋白基因;真核表達;細胞遷移

樁蛋白基因（PXN）位于染色體12q24，有11個外顯子，可編碼559個氨基酸，其蛋白N端有5個亮氨酸-天冬氨酸酸性結合域（LD），可與黏著斑激酶（FAK）和紐蛋白結合，LD1到LD5結構相似但功能各異;樁蛋白N端還有幾個脯氨酸富集SH3結合域;C端有4個串聯(lián)的LIM結構域，每個LIM由2個鋅指結構以疏水作用力結合，其中第3個LIM是樁蛋白與黏著斑蛋白重要結合區(qū)[1-2]。LIM不僅可以介導樁蛋白定位于黏著斑和細胞骨架的肌動蛋白上，還與多種蛋白如微管蛋白、雄激素和糖皮質激素的結合有關。樁蛋白上有許多酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點，參與細胞信號轉導如FAK/Src、ERK等信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，樁蛋白異常表達和異常磷酸化均與細胞生長、細胞黏附和遷移、形態(tài)轉變等密切相關[2]。本研究欲通過克隆PXN基因并使其在肝癌細胞Hep G2中高表達，分析其對肝癌細胞Hep G2生長和遷移的影響。

材料與方法

一、主要材料和試劑

Trizol 和lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司（美國），肝癌細胞株Hep G2購自中科院上海細胞庫，RPMI-1640細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司（美國），限制性核酸內(nèi)切酶、高保真反轉錄試劑盒購自Takara公司（中國大連），新生牛血清購自杭州四季青生物有限公司，去內(nèi)毒素質粒小提中量試劑盒購自北京天根生物有限公司，抗體購自北京博邁德生物有限公司，實時無標記細胞分析（RTCA）板購自艾森生物公司（美國），pEBFP-C1保存于本實驗室。

二、方 法

1.細胞培養(yǎng)

用含10%新生牛血清的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Hep G2細胞。細胞長至80% ～ 90%用0.25%胰酶進行消化傳代。

2. mRNA抽提及PCR反應

將Hep G2鋪板于6 cm培養(yǎng)皿中，等細胞融合至80%時用PBS清洗3次，加入1 ml Trizol，充分吹打裂解細胞，移入1.5 ml離心管中，加入0.2 ml氯仿，劇烈震蕩30 s，室溫靜置10 min，4℃

12 000 轉/分離心10 min，取上清液移入新的1.5 ml離心管中，加入0.5 ml異丙醇，顛倒混勻后4℃ 7 500 轉/分離心10 min，棄去上清，加入1 ml預先配置好的75%的乙醇清洗，4℃ 7 500 轉/分離心10 min，棄去上清，室溫控干，加入RNase-free的雙蒸水100 μl，RNA完整性檢測并定量為1 μg/μl，

-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取4 μg總RNA，然后用逆轉錄試劑盒按20 μl反應體系在42℃逆轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，用PXN基因（NM_002859）引物（5-TGCTCGAGCCATGGACGACCTCGACGCCCTGCT-3，5-CAGAATTCCTAGCAGAAGAGCTTGAGGAAGCAG-3）擴增獲得樁蛋白編碼區(qū)。

3. 真核表達載體構建

用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ對PXN PCR產(chǎn)物和真核表達載體pEBFP-C1進行雙酶切，電泳回收并純化后用T4 DNA ligase 4℃連接過夜，經(jīng)細菌轉化、卡那霉素篩選培養(yǎng)、單克隆挑取與擴大培養(yǎng)、質粒抽提、Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切鑒定后進行DNA測序鑒定，獲得連接正確且未發(fā)生突變的重組質粒pEBFP-PXN。

4.細胞轉染與藥物篩選

轉染前1 d將SMMC-7721細胞按50%量鋪于6孔板中，用lipofectamine 2000將無內(nèi)毒素的重組質粒pEBFP-PXN穩(wěn)定性轉染導入肝癌細胞中，轉染3 d后在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光，并用0.5%的胰酶消化后轉入10 cm細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 d后加入600 μg/ml的G418進行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)7 d后將G418濃度降低為維持濃度200 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)直至單克隆細胞集落形成。熒光顯微鏡下挑取藍色熒光的細胞集落進行擴大培養(yǎng)。

5. 蛋白免疫印跡法

取1.2×106個細胞進行裂解，蛋白定量后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，震蕩混勻后放入金屬浴中100℃煮沸5 min，瞬時離心后震蕩混勻，樣品進行變性電泳、蛋白轉膜和膜封閉后，加入一抗4℃孵育過夜，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗3次，加入二抗室溫孵育2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗3次，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中進行顯色反應。每個實驗重復3次。

6. 細胞劃痕實驗

將細胞按最大數(shù)量接種于12孔板中，24 h后用10 μl槍頭按使用力度相同和劃線粗細相同的原則對細胞以“|”方式進行劃痕，磷酸鹽緩沖液洗去懸浮細胞和細胞碎片，并在0、24、48、72 h拍照記錄，實驗重復3次。

7. RTCA

細胞用0.25%的胰酶消化后重懸，細胞計數(shù)后取一部分細胞稀釋至1×104/ml，充分混勻后取200 μl細胞懸液加入到RTCA儀配套的細胞培養(yǎng)板中，按程序設置實驗名稱、細胞類型、初始數(shù)量、掃描方式和頻率，啟動實驗程序直至實驗結束，實驗重復3次，并對實驗結果進行比對和分析。

三、統(tǒng)計學處理

用SPSS 21.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。組間比較采用獨立樣本t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、重組真核表達載體pEBFP-PXN構建成功

以Hep G2細胞mRNA為模板經(jīng)逆轉錄獲得cDNA，經(jīng)PCR反應獲得PXN基因蛋白編碼區(qū)，經(jīng)Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ雙酶切后插入真核表達載體pEBFP-C1中，構建PXN基因真核表達載體pEBFP-PXN（圖1A）。對pEBFP-PXN用Xho Ⅰ和 EcoR Ⅰ雙酶切進行鑒定（圖1B），并對其進行DNA正反測序，結果證明PXN基因無點突變，正是所需重組質粒。

二、建立PXN基因高表達穩(wěn)轉細胞株

去內(nèi)毒素的重組真核表達質粒pEBFP-PXN用脂質體法穩(wěn)定性轉染肝癌細胞Hep G2，并用G418藥物篩選殺死未轉染的肝癌細胞，當細胞形成單克隆集落時，在熒光顯微鏡下挑取細胞集落并擴大培養(yǎng)，對細胞進行熒光觀察（圖2）。蛋白免疫印跡法檢測分析發(fā)現(xiàn)，單克隆穩(wěn)轉肝癌細胞內(nèi)外源融合蛋白BFP-PXN高表達（圖3A）。

三、PXN基因抑制肝癌細胞遷移并影響EMT標志蛋白表達

為研究PXN基因對肝癌細胞的作用，首先利用RTCA法對穩(wěn)轉肝癌細胞株的生長增殖速率進行測定，如圖4所示，與對照細胞相比，穩(wěn)轉肝癌細胞株的生長增殖速率無顯著變化（72 h：t = 0.438，P = 0.684），證明PXN基因基本不影響Hep G2肝癌細胞的生長增殖速率。然后，利用細胞劃痕-愈合實驗檢測穩(wěn)轉肝癌細胞的遷移能力，結果發(fā)現(xiàn)高表達外源蛋白BFP-PXN的穩(wěn)轉株的細胞遷移能力降低（24 h：t = 5.177，P = 0.007;48 h：t = 8.307，P = 0.001;72 h：t = 5.498，P = 0.005），證明樁蛋白高表達可以抑制Hep G2肝癌細胞的遷移能力（圖5）。同時，蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)，指示細胞間質化的標志蛋白N-Cadherin（t = 4.374，P = 0.049）和Vimentin（t = 10.672，P = 0.009）表達降低，而指示細胞上皮化的標志蛋白E-Cadherin表達升高（t = -10.223，P = 0.009）（圖3B）。

討論

樁蛋白是一種具有多結構域和多功能的黏著斑手腳架蛋白，可通過募集多種結構蛋白和信號分子參與細胞黏附、運動和信號轉導。樁蛋白上有多個酪氨酸和絲氨酸殘基參與磷酸化，與蛋白定位和生物學功能密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，當整合素結合到細胞外基質（ECM）上可以促進樁蛋白的磷酸化水平，從而募集胞內(nèi)多種蛋白包括FAK和Src結合到樁蛋白的N端，結合的FAK可磷酸化樁蛋白的Tyr31和Tyr118，Src可磷酸化Tyr88和Tyr118，使磷酸化的樁蛋白與下游靶蛋白p130cas作用，介導由ERK從胞外傳導來的信號，最終影響細胞的黏附和遷移[3-4]。

在腫瘤細胞中，雖然樁蛋白磷酸化水平與癌細胞的轉移能力呈正相關，但樁蛋白表達量與癌細胞的關系較為復雜[5-8]。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中，樁蛋白表達上調(diào)與腫瘤病理分級高、淋巴管侵襲和淋巴轉移密切相關，并認為這可能與樁蛋白調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白BCL-2表達有關。這一結果與趙珊珊等在卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)的結果極為類似[10]。另外，Shekhar等[11]也發(fā)現(xiàn)在口腔癌中，樁蛋白表達量與腫瘤發(fā)展和進程呈正相關。同樣的，Zheng等[12]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中，樁蛋白表達顯著高于正常組織和良性前列腺增生組織，并與前列腺癌更容易發(fā)生淋巴結轉移、耐化療藥物和術后浸潤相關。但是，在前列腺癌細胞PC-3中，Sobkowicz等[13]發(fā)現(xiàn)用小干擾RNA（siRNA）敲低細胞內(nèi)源性樁蛋白后，前列腺癌細胞的生長速度和轉移侵襲能力未發(fā)生明顯變化;在前列腺癌細胞LNCap中，siRNA敲低細胞內(nèi)源性樁蛋白后，前列腺癌細胞的生長增殖速度和轉移浸潤能力增強，但其黏附能力并未發(fā)生顯著變化。在乳腺癌細胞MDA-MB-231中，敲低內(nèi)源性樁蛋白不影響細胞的增殖能力，但可以增強黏附力和降低細胞浸潤能力[12]。綜上所述，樁蛋白表達高低與腫瘤細胞的增殖、遷移侵襲之間關系較為復雜，它在不同的腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有不同的作用和功能，因此，要全面了解樁蛋白在腫瘤中的作用就需要在不同的腫瘤中用實驗驗證。

原發(fā)性肝癌是一種轉移可能性大的惡性腫瘤，為正確認識樁蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究首先克隆了PXN基因蛋白編碼區(qū)，并構建了真核表達質粒pEBFP-PXN及其穩(wěn)轉單克隆肝癌細胞株[14]。蛋白免疫印跡法分析發(fā)現(xiàn)，高表達外源PXN融合蛋白的肝癌細胞，其細胞增殖速率未發(fā)生顯著改變，但細胞遷移能力明顯受到抑制;同時，細胞內(nèi)上皮化標志蛋白E-Cadherin表達顯著升高，間質化標志蛋白N-Cadherin和Vimentin表達降低，這些結果說明樁蛋白高表達可以抑制肝癌細胞Hep G2的遷移能力，可以作為臨床肝癌診斷和治療的潛在靶標。

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（收稿日期：2019-05-12）

（本文編輯：楊江瑜）