孫景權(quán) 上官若男 李松波 嚴(yán)翊 謝敏豪

摘? ? 要：探究長時(shí)間不同頻率EPS對C2C12肌管細(xì)胞代謝指標(biāo)和基因表達(dá)的影響，試圖建立EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞TG堆積和線粒體功能增強(qiáng)的細(xì)胞模型。方法：采用4種EPS方案誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮，實(shí)驗(yàn)分為5組：對照組（C組）、30 V+2 ms+0.5 Hz組（0.5 Hz組）、30 V+2 ms+1 Hz組（1 Hz組）、30 V+2 ms+5 Hz組（5 Hz組）、30 V+2 ms+10 Hz組（10 Hz組）。比色法檢測細(xì)胞內(nèi)TG、乳酸和ATP含量，RT-PCR方法檢測細(xì)胞中IL-6、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡb、MyHCⅡx、Cyt C和PGC-1α等mRNA含量。結(jié)果：1）與C組相比，EPS后即刻，頻率0.5～10 Hz組乳酸含量非常顯著增加（P<0.01）;頻率1 Hz和10 Hz組細(xì)胞中ATP含量均顯著降低（P<0.05），其中頻率0.5 Hz和5 Hz組細(xì)胞中ATP含量非常顯著降低（P<0.01）。2）與C組相比，頻率0.5 Hz和1 Hz組MyHCⅠ和MyHCⅡb的mRNA含量顯著增加（P<0.05），頻率5 Hz組MHC4種亞型mRNA含量變化不明顯（P>0.05），頻率10 Hz組MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡb亞型mRNA含量非常顯著降低（P<0.01），而MyHCⅡx亞型mRNA含量非常顯著增加（P<0.01）。3）與C組相比，頻率0.5～10 Hz組PGC-1α和Cyt C mRNA含量均顯著增加（P<0.05），同時(shí)EPS增加了C2C12細(xì)胞中IL-6 mRNA的含量（P<0.05）。4）與C組相比，4 d EPS方案停止后12 h，各組肌管細(xì)胞中TG含量均沒有出現(xiàn)變化;4 d EPS方案停止后24 h，0.5 Hz組和1 Hz組肌管細(xì)胞中TG含量增加但無顯著性（P>0.05）;4 d EPS方案停止后36 h，0.5 Hz組和5 Hz組細(xì)胞中TG含量顯著增加（P<0.05）。結(jié)論：EPS方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d，EPS停止后36 h）能夠明顯誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞TG含量堆積和線粒體功能增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：EPS;C2C12 肌管細(xì)胞;線粒體;TG;電脈沖;模型

中圖分類號：G 804.8? ? ? ? ? 學(xué)科代碼：040302? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract：Objective： To explore the effect of long time and different frequency electrical stimulation on the metabolic index and gene expression in C2C12 myotubes， so as to establish a cell model for EPS-induced TG accumulation and the increase of mitochondrial function in C2C12 myotubes. Methods： Four protocols of EPS were used to induce contraction of C2C12 myotubes. The experiment was divided into five groups： control group （C group）， 30V 2ms 0.5Hz group （0.5Hz group）， 30V 2ms 1Hz group （1Hz group）， 30V 2ms 5Hz. Group （5Hz group）， 30V 2ms 10Hz group （10Hz group）. Colorimetric assay was used to detect intracellular TG， lactate， and ATP content. RT-PCR was used to detect mRNA levels of IL-6， MyHCⅠ， MyHCⅡa， MyHCⅡb， MyHCⅡx， Cyt C， and PGC-1α. Results： 1） Compared with C group， the lactate content in the 0.5Hz-10Hz group was significantly increased （P<0.01） immediately after stimulation， and the ATP content in cells was significantly decreased in the 1Hz and 10Hz groups （P<0.05）. However， the ATP content in cells at 0.5 Hz and 5 Hz groups significantly decreased （P<0.01）. 2） Compared with C group， MyHCⅠ and MyHCⅡb were significantly increased in the 0.5 Hz/1 Hz group （P<0.05）， and the four myosin heavy chain isoforms exhibited no change in 5 Hz group （P>0.05）. The mRNA content of MyHCⅠ， MyHCⅡa， and MyHCⅡb subtypes was significantly decreased （P<0.01） in the 10 Hz group， while the mRNA levels of MyHCⅡx isoform was significantly increased （P<0.01）. 3） Compared with C group， the mRNA content of PGC-1α and Cytochrome C were significantly increased （P<0.05） in 0.5-10 Hz group， and the mRNA content of IL-6 was significantly increased by EPS in C2C12 cells （P<0.05）. 4） Compared with C group， TG content in EPS groups did not change in 12h after 4d electrical stimulation， and the TG content in 0.5Hz and 1Hz groups were increased in 24h after 4d electrical stimulation but there was no significant difference （P>0.05）; however， the TG content in 0.5 Hz and 5 Hz groups were significantly increased in 36h after 4d electrical stimulation （P<0.05）. Conclusion： the EPS protocols （Voltage 14V， a single stimulation duration 2ms， frequency 1Hz， a stimulation time of 2h， a total 2 days， followed by， voltage 30 V， a single stimulation duration 2ms， frequency 0.5 Hz or 1 Hz or 5Hz， a stimulation time of 3 h， and a total 2 days） have induced TG accumulation and mitochondrial function enhancement in C2C12 myotubes.

Keywords：EPS; C2C12 myotubes; mitochondria; TG; electrical pulse stimulation; model

許多研究表明，長期耐力訓(xùn)練能夠增加骨骼肌細(xì)胞中甘油三酯（triglyceride，TG）的含量和線粒體氧化脂肪酸能力，這與耐力性項(xiàng)目運(yùn)動員骨骼肌耐力水平的增加有直接關(guān)系[1-3]。在長時(shí)間低強(qiáng)度運(yùn)動中，骨骼肌收縮所需要的能量中有90%來源于游離脂肪酸的氧化代謝[4]。肌細(xì)胞內(nèi)TG作為局部的高密度能量，其可以通過脂解作用釋放脂肪酸來為骨骼肌收縮提供能量[5-6]。不論是耐力性項(xiàng)目運(yùn)動員[7-8]、Ⅱ型糖尿病患者[2]還是老年人人群（60～75歲）[1，9]，長時(shí)間中等強(qiáng)度的運(yùn)動鍛煉均可以提升骨骼肌細(xì)胞的TG含量、骨骼肌胰島素敏感性、Ⅰ型骨骼肌纖維脂肪酸利用能力及骨骼肌整體氧化能力，但是運(yùn)動誘發(fā)骨骼肌出現(xiàn)這些健康效應(yīng)的分子機(jī)制還不清楚。通過研究骨骼肌細(xì)胞對收縮刺激的適應(yīng)性變化，是闡明運(yùn)動誘發(fā)骨骼肌產(chǎn)生健康效應(yīng)機(jī)制的主要方法之一[10]。

一個(gè)科學(xué)的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型是研究生物學(xué)現(xiàn)象機(jī)制的重要工具。在細(xì)胞培養(yǎng)中，電脈沖刺激（electrical pulse stimulation，EPS）能夠加快骨骼肌細(xì)胞（肌管）分化，它能夠替代神經(jīng)電信號激活骨骼肌纖維[11-12]。目前，一些研究中已經(jīng)出現(xiàn)使用EPS誘導(dǎo)細(xì)胞收縮的模型[13]。1997年，有研究發(fā)現(xiàn)，采用EPS激活培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞后，其能夠引起骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生收縮[11]。隨后在2007年，有研究發(fā)現(xiàn)EPS能夠加速骨骼肌細(xì)胞肌節(jié)的形成[12]。近幾年，許多研究發(fā)現(xiàn)EPS能夠誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)和代謝特征的變化。例如一次性長時(shí)間EPS（14 V，1 ms，50 Hz，24 h）能夠顯著增加氧化型MyHCⅠ和MyHCⅡx，同時(shí)增加PGC-1α、Cyt C和中鏈乙酰輔酶A脫氫酶（medium chain acyl-coA dehydrogenase，MCAD）蛋白表達(dá)量，即顯著增加骨骼肌氧化功能[14]。一次性短時(shí)間高頻EPS（電壓30 V，單次時(shí)長200 ms，頻率100 Hz，持續(xù)5～60 min）能夠顯著增加骨骼肌細(xì)胞脫氧葡萄糖攝入量和乳酸產(chǎn)生量，同時(shí)降低磷酸肌酸含量;而一次性長時(shí)間低頻EPS顯著增加骨骼肌細(xì)胞葡萄糖和脂肪酸氧化能力，丙酮酸脫氫酶復(fù)合物4、IL-6、Cyt C、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶B和MyHCⅠ蛋白和mRNA表達(dá)量顯著增高[13]。但是，目前還鮮少見到長時(shí)間EPS誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞收縮進(jìn)而導(dǎo)致TG堆積和線粒體功能增強(qiáng)的成功建立的細(xì)胞模型。

綜上所述，本研究采用長時(shí)間不同頻率的EPS方案誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮，檢測C2C12細(xì)胞中TG含量、乳酸含量、肌細(xì)胞收縮蛋白和線粒體相關(guān)功能蛋白含量變化情況，試圖建立EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮并伴隨TG堆積和線粒體功能增加的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究長期運(yùn)動鍛煉增加肌細(xì)胞中TG含量并伴隨線粒體功能增強(qiáng)的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1? ?材料和方法

1.1? 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠成肌細(xì)胞細(xì)胞株C2C12（CRL-1772），接種于含培養(yǎng)基的100 mm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基包含高糖DMEM（4.00 mM L-谷氨酰胺，4 500 mg/L葡萄糖，無丙酮酸鈉，HyClone，貨號SH30022.01，美國猶他州洛根市）、10%胎牛血清（Ausvin，貨號VS500T，澳大利亞）、1%青鏈霉素混合液（貨號KGY0023，購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（貨號KGY0012，購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行細(xì)胞消化。對于本次實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞被鋪入6孔板（Corning，New York，USA）。當(dāng)6孔板中細(xì)胞融合到90～95%時(shí)，將C2C12細(xì)胞培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基（高糖DMEM，2%馬血清，1%青鏈霉素混合液）。每24 h更換一次分化培養(yǎng)基。細(xì)胞分化4～6 d后，分化完成的肌管細(xì)胞被用于EPS處理。

1.2? EPS方案

本研究使用儀器C-Pace EP culture pacer（IonOptix，Dublin，Ireland）產(chǎn)生EPS使肌管細(xì)胞收縮。此儀器能夠發(fā)出雙極性脈沖到懸掛在培養(yǎng)基中的C-dish碳電極上。EPS方案如下：EPS共持續(xù)4 d，第1天和第2天：電壓14 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率1 Hz，電刺激總時(shí)間2 h;第3天和第4天：電壓30 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率分別為0.5 Hz、1 Hz、5 Hz和10 Hz，電刺激總時(shí)間3 h（見表1）?；诖耍狙芯繉?shí)驗(yàn)細(xì)胞被分為5組：對照組（C組）、30 V+2 ms+0.5 Hz組（0.5 Hz組）、30 V+2 ms+1 Hz組（1 Hz組）、30 V+2 ms+5 Hz組（5 Hz組）、30 V+2ms+10 Hz組（10 Hz組），其中C組為未進(jìn)行電刺激組。每1組均包含6個(gè)孔的細(xì)胞作為檢測對象（n=6）。EPS前1 h每孔更換2 mL新配分化培養(yǎng)基。EPS每天進(jìn)行1次，共持續(xù)4 d。根據(jù)以往研究[14]，在最后一次EPS后3 h收集細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行MHC亞型、IL-6、PGC-1α、Cyt C等mRNA含量測試。另外，分別在最后一次EPS后即刻、12 h、24 h和36 h后收集細(xì)胞，使用裂解液后提取蛋白質(zhì)和進(jìn)行TG、ATP等含量的測試。

1.3? 細(xì)胞中TG測試

肌管細(xì)胞中總TG含量采用組織甘油三酯酶法測定試劑盒（組織細(xì)胞）（E1013，購自北京普利萊（APPLYGEN）基因技術(shù)有限公司）進(jìn)行測試，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。最后使用酶標(biāo)儀（benchmark plus microplate spectrophotometer，BIO-RAD，California，USA） 在550 nm波長下測量吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品讀數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算樣品中TG濃度。樣品中相對TG含量使用細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.4? 細(xì)胞中乳酸含量測試

細(xì)胞中乳酸含量測定使用乳酸比色法測定試劑盒（貨號：#K607-100，BioVision，Milpitas CA，USA），測試方法依照說明書進(jìn)行。最后，使用酶標(biāo)儀（BIO-RAD，California，USA）在波長570 nm下讀取吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中乳酸含量（nmoL），根據(jù)公式計(jì)算：

樣品乳酸濃度=每孔中乳酸含量（nmoL）/每孔中樣品體積（μL）×樣品稀釋比例。（1）

樣品中相對乳酸含量使用細(xì)胞總蛋白濃度進(jìn)行校準(zhǔn)。

1.5? 細(xì)胞中ATP含量測試

細(xì)胞中ATP含量測試使用ATP檢測試劑盒（貨號：S0026，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司），測試方法依照說明書進(jìn)行。最后，在檢測孔內(nèi)加上20 μL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用微量移液器混勻，至少間隔2 s后，用GloMaxR 20/20 Luminometer化學(xué)發(fā)光檢測儀（貨號：E5311，美國Promega-GloMax Promega GloMax）測定RLU值;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度，相對ATP含量用樣品中蛋白濃度校準(zhǔn)。

1.6? 蛋白質(zhì)提取及濃度測定

6孔板中每孔加細(xì)胞裂解液（貨號：110000-L2，購自北京賽馳生物科技有限公司） 200? μL，用細(xì)胞刷將細(xì)胞刮下，收集在1.5 mL離心管中，置于冰上。用槍頭反復(fù)吹吸細(xì)胞沉淀，8～10次，以充分懸浮細(xì)胞。旋渦劇烈震蕩1 min，靜置15 min。期間取出震蕩2～3次，每次30 s。4 ℃離心，12 000 g，15 min，將上清分裝至預(yù)冷離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆??？偟鞍诐舛葴y定采用Thermo Scientific公司的BCA蛋白定量分析試劑盒（Prod# 23225，Life technologies，Eugene，Oregon），采用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測試方法依照說明書進(jìn)行。

1.7? 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR

細(xì)胞中總RNA提取采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit（貨號9767，Takara），操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。然后，使用微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000）測定總RNA濃度，純度要求：A260/A280比值在1.9～2.0，RNA濃度=A260×稀釋倍數(shù)×0.04 μg/μL。提出的mRNA使用PrimeScriptTM RT Master Mix （Perfect Real Time）（貨號：RR036A，Takara）來進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后Bio-RAD上機(jī)，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)?7 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃無窮。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。使用SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（貨號：RR820A，Takara）試劑盒。按照試劑盒說明書要求配制20 μL的反應(yīng)體系，在Applied Biosystems7500 Fast Real-Time PCR System儀器上進(jìn)行定量分析。兩步法 PCR 擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s的PCR反應(yīng)設(shè)置40個(gè)循環(huán);之后熔解曲線程序95 ℃ 15 s，60 ℃15 s，95 ℃ 60 s，并且用核糖體18S1 RNA作為內(nèi)參基因校準(zhǔn)。PGC-1α、MyHCⅠ、MyHCⅡa、MyHCⅡx、MyHCⅡb、Cyt C、IL-6和18S rRNA mRNA采用SYBR green方法進(jìn)行檢測。引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司，序列見表2，并且用18S rRNA進(jìn)行內(nèi)參基因校準(zhǔn)。定量方法用2—△△Ct表示基因的表達(dá)量。計(jì)算公式為：

△△Ct=[Ct（實(shí)驗(yàn)組目的基因）-Ct（18S1）]-[Ct（對照組目的基因）-Ct（18S1）]（2）

1.8? 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（X±SEM）表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。組間比較采用單因素方差分析，顯著水平取P<0.05，非常顯著水平取P<0.01。作圖軟件采用Excel 2010和GraphPad Prism 5。

2? ?結(jié)果

2.1? 一次性EPS對C2C12肌管細(xì)胞中乳酸和ATP含量的影響

為了檢測EPS誘導(dǎo)肌管細(xì)胞收縮后細(xì)胞中乳酸和ATP含量的變化，分化4～6 d的肌管細(xì)胞先進(jìn)行2 d EPS（電壓14 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率1 Hz，EPS總時(shí)間2 h/d），第3 d進(jìn)行一次性高電壓不同頻率刺激（電壓30 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率分別為0.5 Hz、1 Hz、5 Hz和10 Hz，EPS總時(shí)間3 h）。EPS后即刻收集細(xì)胞檢測乳酸和ATP含量，采用單因素方差分析事后檢驗(yàn)方法計(jì)算結(jié)果。

如圖1所示，與C組相比，一次性的電壓30 V、頻率0.5 Hz和10 Hz、單次時(shí)長2ms、共3 h的EPS均能顯著升高刺激即刻時(shí)C2C12肌管細(xì)胞中乳酸含量（P<0.05），同時(shí)發(fā)現(xiàn)電壓30 V、頻率1 Hz和5 Hz、單次時(shí)長2 ms、共3 h的EPS均能非常顯著升高刺激即刻時(shí)C2C12肌管細(xì)胞中的乳酸含量（P<0.01）。如圖2所示，與C組相比，一次性的電壓30 V、頻率0.5～10 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS均能夠非常顯著降低C2C12細(xì)胞中的ATP含量（P<0.01）。

2.2? 不同EPS方案對C2C12肌管細(xì)胞中MHC亞型mRNA含量的影響

本研究觀察這幾種EPS方案是否能夠改變C2C12肌管細(xì)胞中4種MHC亞型的mRNA含量。如圖3所示，與C組相比，電壓30 V、頻率0.5 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS有增加氧化型蛋白重鏈Ⅰ型（P<0.05）和快肌纖維標(biāo)志性肌球蛋白重鏈Ⅱb型mRNA含量的趨勢，但未見顯著性（P<0.05）。電壓30 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS能夠顯著增加氧化型蛋白重鏈I型（P<0.05）和快肌纖維標(biāo)志性肌球蛋白重鏈Ⅱb型mRNA含量（P<0.01）。而電壓30 V、頻率5 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的電刺激對骨骼肌MHC4種亞型mRNA含量的影響不明顯。然而，電壓30 V、頻率10 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS非常顯著降低MyHCⅠ、MyHCⅡa和MyHCⅡb亞型mRNA含量（P<0.01），非常顯著增加MyHCⅡx亞型mRNA含量（P<0.01）。

2.3? 不同EPS方案對C2C12肌管細(xì)胞中線粒體相關(guān)功能蛋白mRNA含量的影響

本研究檢測了EPS對線粒體相關(guān)蛋白Cyt C、PGC-1α和IL-6mRNA含量的影響。如圖4A所示，與C組相比，電壓30 V、頻率0.5～10 Hz、單次時(shí)長2 ms的EPS方案均能夠顯著增加C2C12肌管細(xì)胞中Cyt C mRNA表達(dá)量（P<0.05）。如圖4B所示，與C組相比，電壓30 V、頻率1～10 Hz、單次時(shí)長2 ms的EPS方案均能夠顯著增加C2C12肌管細(xì)胞中PGC-1αmRNA含量（P<0.05），而0.5 Hz組有增加趨勢但無顯著性（P>0.05）。如圖4 C所示，與C組相比，隨著頻率的增加，C2C12細(xì)胞中IL-6 mRNA含量出現(xiàn)增加趨勢，至10 Hz呈現(xiàn)非常顯著性增加（P<0.01）。

2.4? 不同EPS方案對C2C12肌管細(xì)胞中TG含量的影響

如圖5所示，與C組相比，4 d電刺激方案（電壓30 V，頻率0.5～5 Hz，單次時(shí)長2 ms）停止后12 h肌管細(xì)胞中TG含量均沒有出現(xiàn)變化。4 d電刺激方案停止后24 h，與C組相比， 0.5 Hz組和1 Hz組肌管細(xì)胞中TG含量增加但未見顯著性（P>0.05）。4 d電刺激方案停止后36 h，與C組相比，0.5 Hz組和5 Hz組細(xì)胞中TG含量顯著增加（P<0.05），1 Hz組細(xì)胞中TG含量非常顯著增加（P<0.01）。

3? ?討論

本文的研究目的是采用EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮來模擬運(yùn)動性骨骼肌收縮，從而研究不同EPS方案對C2C12肌管細(xì)胞TG、乳酸、ATP、MHC亞型和線粒體相關(guān)功能蛋白mRNA含量的影響，試圖建立EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞TG堆積和線粒體功能增加模型，為研究長期運(yùn)動鍛煉增加骨骼肌細(xì)胞中TG堆積并伴隨線粒體功能增加的機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)方案。本研究結(jié)果如下：1）一次性的電壓30 V、頻率0.5～10 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的電刺激均能夠非常顯著增加C2C12細(xì)胞中乳酸含量并降低ATP含量;2）電刺激方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d，EPS停止后36 h）均能夠顯著誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞中TG堆積和線粒體功能蛋白mRNA含量增加，在細(xì)胞水平上為進(jìn)一步建立長期運(yùn)動鍛煉誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞TG堆積和線粒體功能增強(qiáng)模型打下良好基礎(chǔ)。

3.1? 不同EPS方案誘發(fā)的C2C12肌管細(xì)胞收縮

規(guī)律性體力活動對健康具有促進(jìn)作用，比如預(yù)防和治療各種慢性疾病（Ⅱ型糖尿病、心血管疾病、抑郁癥等）[15]。研究還顯示運(yùn)動過程中收縮的骨骼肌通過分泌肌因子參與調(diào)節(jié)運(yùn)動使健康受益的過程[16]。近年來，在關(guān)于骨骼肌細(xì)胞運(yùn)動適應(yīng)性分子機(jī)制的研究中，EPS刺激骨骼肌細(xì)胞已經(jīng)作為鑒定新穎肌肉因子的主要工具。尤其是近來發(fā)現(xiàn)的人類骨骼肌細(xì)胞的EPS方案，其對于理解規(guī)律性運(yùn)動和健康促進(jìn)之間分子機(jī)制具有重要作用[17]。體外細(xì)胞模型可能適用于研究收縮細(xì)胞（尤其是不同運(yùn)動方案誘發(fā)細(xì)胞收縮）的信號通路和代謝適應(yīng)性變化過程[18]。使用模擬骨骼肌收縮的體外模型，在理解骨骼肌代謝調(diào)控作用與其他器官之間復(fù)雜和多方向的“crosstalk”方面已經(jīng)起到實(shí)質(zhì)性進(jìn)展[19]。研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)水平上，給予細(xì)胞EPS處理有利于骨骼肌細(xì)胞分化成肌管細(xì)胞，這些研究顯示EPS能夠激活骨骼肌細(xì)胞并且可以作為一種神經(jīng)電信號的替代方法[11-12]。早期研究發(fā)現(xiàn)，不同電刺激方案誘導(dǎo)MHC亞型中快肌和慢肌的特異性改變，因此，確認(rèn)EPS是研究體外骨骼肌收縮活性的一種有效模型[20]。C2C12細(xì)胞和主要大鼠細(xì)胞株對EPS是敏感的，它們主要被用于研究骨骼肌收縮-誘導(dǎo)代謝改變的過程。第1個(gè)報(bào)道EPS作為一種體外運(yùn)動模型應(yīng)用到骨骼肌細(xì)胞研究中的是C2C12細(xì)胞[21]。在此研究中，Nedachi等 [21]發(fā)現(xiàn)EPS誘導(dǎo)肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯收縮，同時(shí)伴隨AMPK和MAPK激活、葡萄糖攝入量和胰島素敏感性增加。本研究首先要確定不同EPS方案是否能夠誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮，采用EPS后肌管細(xì)胞中乳酸含量、ATP含量及MHC亞型mRNA含量變化作為判定肌管細(xì)胞收縮的指標(biāo)。Nikolic等[13]采用一次性高頻率EPS方案（30 V，100 Hz，間歇5 s，脈沖持續(xù)時(shí)間200 ms共5～60 min）能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)乳酸含量、增加葡萄糖攝入量、降低ATP和PCr含量。本研究采用EPS方案為：分化4～6 d的肌管細(xì)胞，先進(jìn)行2 d EPS（電壓14 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率1 Hz，電刺激總時(shí)間2 h/d），其目的為利用此EPS方案來加速C2C12肌管與肌小節(jié)的生成[12];第3 天和第4 天分別進(jìn)行一次高電壓不同頻率刺激（電壓30 V，單次刺激時(shí)長2 ms，頻率分別為0.5 Hz、1 Hz、5 Hz和10 Hz，EPS總時(shí)間3 h）。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：一次性EPS方案（電壓30 V、頻率0.5和10 Hz、脈沖2 ms 共3 h）也能夠顯著增加刺激后即刻細(xì)胞內(nèi)乳酸含量，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)ATP含量。另一個(gè)EPS方案（電壓11.5 V，頻率1 Hz，脈沖2 ms共2～24 h）也發(fā)現(xiàn)低頻刺激能夠?qū)е录?xì)胞骨架的重組、肌節(jié)結(jié)構(gòu)重新合成和肌管明顯收縮[22]。這些結(jié)果說明本研究采用的EPS方案能夠促進(jìn)肌管細(xì)胞收縮并消耗ATP作為能源供應(yīng)。同時(shí)本研究也成功建立C2C12肌管細(xì)胞收縮后乳酸堆積模型，而且發(fā)現(xiàn)電壓30 V是誘導(dǎo)C2C12肌管細(xì)胞乳酸堆積的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)。另外，MHC亞型基因表達(dá)情況常被用于區(qū)分不同骨骼肌纖維類型[23]。大量的研究表明，EPS能夠?qū)е翸HC亞型基因表達(dá)的改變。長時(shí)間低頻EPS促進(jìn)大鼠肌管細(xì)胞分化和增加慢肌纖維類型標(biāo)志物MyHCⅠ表達(dá)[24]。同時(shí)，在持續(xù)2周EPS過程中，肌纖維由快肌類型逐漸過渡到慢肌類型[25]。也有研究發(fā)現(xiàn)，1周EPS方案（電壓7.5 V，頻率3 Hz，脈沖10 ms，每次10 min）和1周EPS方法（電壓7.5 V、頻率3 Hz，脈沖10 ms，每次30 min）均使快肌纖維表達(dá)量降低而慢肌纖維則無改變[26]。另外，研究報(bào)道：電壓30 V、頻率1 Hz、脈沖時(shí)長2 ms共24 h或者48 h 的EPS能夠顯著增加MyHCⅠ（慢縮氧化型肌纖維標(biāo)志物）含量[13]。這些結(jié)果表明，長時(shí)間低頻EPS促進(jìn)肌管細(xì)胞慢肌纖維增加。本研究數(shù)據(jù)也顯示：電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS能夠顯著增加MyHCⅠ和MyHCⅡb型mRNA含量，這說明這一EPS方案能夠顯著增加骨骼肌氧化型和快速收縮型肌纖維含量，這可能與本研究所采用的電刺激方案中電壓較大且持續(xù)時(shí)間相對較短有關(guān)。而電壓30 V、頻率10 Hz、單次時(shí)長2 ms共3 h的EPS相對C2C12肌管細(xì)胞來說強(qiáng)度較大，主要以增加快縮型MyHCⅡb亞型mRNA含量為主。另外，IL-6被認(rèn)為是機(jī)體骨骼肌收縮的另一個(gè)標(biāo)志細(xì)胞因子[27-28]。Nedachi等[21]研究發(fā)現(xiàn)24 hEPS（頻率1 Hz）誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞中許多來源于收縮骨骼肌細(xì)胞肌因子的表達(dá)，例如IL-6和CXCL等。本研究也發(fā)現(xiàn)：EPS方案能夠使C2C12肌管細(xì)胞中IL-6 mRNA含量增加，而且呈現(xiàn)頻率依賴性。綜合這些數(shù)據(jù)，認(rèn)為本研究采用的EPS方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30V、頻率0.5 Hz～10 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d）能夠誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞收縮。

3.2? 長時(shí)間不同頻率EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞代謝指標(biāo)和基因表達(dá)變化

大量研究表明，長時(shí)間耐力訓(xùn)練能夠增加骨骼肌細(xì)胞中TG含量和線粒體功能。例如耐力性項(xiàng)目運(yùn)動員往往伴隨著骨骼肌細(xì)胞中脂滴含量增加和線粒體功能增強(qiáng)[7-8]。同時(shí)，長時(shí)間鍛煉中老年人其骨骼肌細(xì)胞中脂質(zhì)含量顯著增加伴隨骨骼肌氧化能力增強(qiáng)[1，7]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)2周的訓(xùn)練（有氧耐力和間隙功率自行車訓(xùn)練）就能夠使無訓(xùn)練男性（年齡（23.3±3.2）歲）股外側(cè)肌中的IMCL顯著增加（42±14）%[3]，但是其機(jī)制目前尚不清楚。建立一種能夠模擬長時(shí)間運(yùn)動誘發(fā)骨骼肌收縮的體外細(xì)胞模型從而研究其機(jī)制顯得尤為重要。本研究探究了長時(shí)間不同頻率EPS對C2C12肌管細(xì)胞代謝指標(biāo)和基因表達(dá)的影響，其將為研究長時(shí)間耐力訓(xùn)練增加骨骼肌細(xì)胞TG含量的機(jī)制提供幫助。本研究發(fā)現(xiàn)：電壓30 V、單次刺激時(shí)長2 ms、頻率分別為0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、停止電刺激后36 h的方案能夠顯著增加C2C12肌管細(xì)胞TG含量。本研究結(jié)果顯示：EPS能夠顯著增加C2C12肌管細(xì)胞分泌乳酸含量、降低ATP含量和改變MHC亞型mRNA含量等，本研究認(rèn)為此EPS方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d，EPS停止后36 h）是可用于研究長期運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)骨骼肌TG堆積的成功建立的細(xì)胞模型。

另外，耐力訓(xùn)練誘發(fā)線粒體功能和氧化能力增強(qiáng)[29-30]。PGC-1α作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，是線粒體功能和合成增加的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[31]。作為肌肉訓(xùn)練的標(biāo)志蛋白，PGC-1α常被認(rèn)為是運(yùn)動誘發(fā)骨骼肌出現(xiàn)代謝改變的細(xì)胞內(nèi)因子[13，32]。PGC-1α這一線粒體蛋白是作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用，其mRNA含量代表著線粒體功能和合成能力[31]。研究發(fā)現(xiàn)長時(shí)間EPS能使PGC-1αmRNA含量增加2.4～2.9倍[14]。Cyt C是線粒體氧化呼吸電子傳遞鏈成分，其含量高低代表著細(xì)胞線粒體氧化還原功能[33]。本研究采用的EPS方案均能夠顯著增加C2C12肌管細(xì)胞中PGC-1α和Cyt C 的mRNA含量。另外，被認(rèn)為是機(jī)體骨骼肌收縮的標(biāo)志肌源性細(xì)胞因子之一的IL-6[27-28]，EPS后細(xì)胞中含量也出現(xiàn)增多。Nikolic等[13]采用的48 hEPS能夠增加線粒體含量和檸檬酸合成酶活性。Lambernd等[22]發(fā)現(xiàn)24 hEPS方案可增加蛋白復(fù)合物Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ含量。這些說明EPS使C2C12肌管細(xì)胞線粒體出現(xiàn)適應(yīng)性變化，線粒體功能增強(qiáng)。EPS誘導(dǎo)PGC-1α增加與骨骼肌氧化型肌纖維類型增多的結(jié)果是一致的，因此PGC-1α作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，它的升高伴隨著骨骼肌類型由糖酵解、快縮型向氧化型肌纖維類型轉(zhuǎn)化[34-35]。EPS誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞Cyt C和PGC-1α mRNA含量的增加，這可能是由于EPS促使肌管細(xì)胞收縮分泌乳酸引起的。因?yàn)檠芯堪l(fā)現(xiàn)：6 h乳酸處理L6細(xì)胞后其Cyt C和PGC-1α的mRNA含量和蛋白含量顯著增加[36]。綜上所述，電刺激方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d，EPS停止后36 h）均能夠顯著誘發(fā)骨骼肌細(xì)胞中線粒體功能蛋白mRNA含量增加，同時(shí)“乳酸”這一代謝物將為長期運(yùn)動訓(xùn)練增加骨骼肌線粒體功能增加提供新思路。

4? ?結(jié)論

EPS方案（電壓14 V、頻率1 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天2 h共2 d，緊接著，電壓30 V、頻率0.5 Hz或1 Hz或5 Hz、單次時(shí)長2 ms和每天3 h共2 d，EPS停止后36 h）能夠誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞TG堆積和線粒體功能增強(qiáng)，該方案是誘發(fā)C2C12肌管細(xì)胞TG堆積和線粒體功能增強(qiáng)的成功建立的細(xì)胞模型。

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