宦 徽，胡 紅，陳小紅，高薇娜，李玲麗，李 驥，鄧 凱，劉 超

宦徽，胡紅，陳小紅，高薇娜，李玲麗，李驥，劉超，四川大學(xué)華西醫(yī)院成辦分院消化內(nèi)科 四川省成都市 610041

鄧凱，四川大學(xué)華西醫(yī)院消化內(nèi)科 四川省成都市 610041

核心提要：通過腸道菌群高通量測序，探討藏族肝硬化患者腸道菌群結(jié)構(gòu)、豐度與多樣性，并對比漢族肝硬化患者腸道菌群的差異及特點.結(jié)論：藏族肝硬化患者的腸道微生物豐度明顯低于漢族肝硬化患者，腸道微生物組成存在著差異.

0 引言

在我國，肝硬化占所有疾病的1.39%，占全部肝病住院病例的51.1%，是我國最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，而在藏區(qū)這一疾病的高發(fā)性尤為突出.大量研究證實在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象.藏族人群生活環(huán)境和飲食習(xí)慣有別于漢族人群，這些差異可能影響腸道菌群，目前缺乏藏族肝硬化患者腸道菌群的研究，國內(nèi)國外均未見報道，亟待相關(guān)研究填補(bǔ)空白.本研究對比藏族肝硬化與漢族肝硬化患者腸道菌群差異，為下一步探索個性化治療提供依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 前瞻性納入2017-10/2018-10四川大學(xué)華西醫(yī)院成辦分院消化內(nèi)科41例肝硬化患者.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝硬化患者(存在可引起肝硬化的病因；存在門靜脈高壓和或肝功能障礙表現(xiàn)；腹部CT或彩超等影像學(xué)證據(jù)支持)；(2)年齡18-75歲；(3)同意參加本臨床研究并簽署知情同意書(2017研第10號).排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有外科分流、肝葉切除、肝移植手術(shù)等肝臟手術(shù)史者；(2)未控制的感染或敗血癥；(3)合并惡性腫瘤患者；(4)近2 wk內(nèi)使用抗生素、類固醇等激素和益生菌制劑；(5)惡病質(zhì)；(6)妊娠期或哺乳期女性；(7)1 mo內(nèi)有腸道感染病史者；(8)存在重要器官功能衰竭的患者；(9)藏族患者離開高原環(huán)境2 wk以上，且飲食習(xí)慣發(fā)生明顯改變者.

其中，1例因存在重要器官功能衰竭；2例藏族患者因離開高原環(huán)境2 wk以上且飲食習(xí)慣發(fā)生明顯改變；1例合并惡性腫瘤；1例近2 wk內(nèi)使用抗生素被排除，最終36例納入本研究.將此中20例藏族肝硬化患者設(shè)為實驗組；16例漢族肝硬化患者設(shè)為對照組.收集患者基本信息、血常規(guī)、生化、凝血功能、影像學(xué)等.

1.2 方法

1.2.1 糞便樣本的收集與DNA提?。翰杉?6例肝硬化患者的大便標(biāo)本(在清潔環(huán)境中采集研究對象的新鮮糞便(不少于6 g)，采集到的糞便樣本立即放入-80 ℃冰箱進(jìn)行凍存.采用DNA提取試劑盒(DNeasy PowerSoil Kit，天根生化科技有限公司，中國北京)對糞便樣本的總DNA進(jìn)行提取，提取方法參考試劑盒操作說明書.提取得到的總DNA用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，用并用NanoDrop檢測DNA的濃度.檢測合格的DNA放入-20 ℃凍存待下一步的操作.

1.2.2 16S rRNA基因V4區(qū)擴(kuò)增與測序結(jié)果分析：使用16S rRNA基因通用引物343F(5'-TACGGRAGGCAGCAG-3')和798R(5'-AGGGTATCTAATCCT-3')對V4區(qū)可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用Illumina Miseq平臺進(jìn)行高通量測序，由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成(中國上海).采用QIIME 1.8.0軟件對測序原始結(jié)果進(jìn)行過濾，過濾得到的clean tags按照97%的相似性進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類，對分類的OTUs進(jìn)行物種注釋分析，并進(jìn)行Alpha多樣性計算，包括香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、辛普森(Simpson)指數(shù)和豐富度指數(shù)Chao1.此外，根據(jù)分類學(xué)層次門和屬分析微生物的群落結(jié)構(gòu)以及物種豐度.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.呈正態(tài)分布的計量資料以mean±SD表示，比較采用方差分析；非正態(tài)分布，資料以中位數(shù)及四分位數(shù)表示，比較采用Kruskal-Wallis檢驗.計數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗.基于Illumina Miseq測序平臺獲得關(guān)于腸道細(xì)菌16S rDNA的測序結(jié)果，并在對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后，采用相應(yīng)的生物數(shù)據(jù)分析方法比較各組腸道菌群情況.P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 一般資料 兩組在性別、年齡、白蛋白、總膽紅素、PT、腹水及Child-Pugh評分均無顯著差異(表1).

2.2 測序質(zhì)量統(tǒng)計 收集到的36個樣本進(jìn)行16S rDNA基因序列測序，利用QIIME軟件對原始序列進(jìn)行過濾，最終對照組和實驗組分別得到平均19963和48338條clean tags，其中有效tags分別為15006(75.17%)和36872(76.28%)，有效tags平均讀長分別為428 bp和431 bp.Shannon指數(shù)稀釋曲線顯示在Shannon指數(shù)為4-6時，絕大多數(shù)樣本的稀釋曲線趨向平坦，說明測序深度合理(圖1).

2.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是對樣本中物種多樣性的分析，基于OTU種類和豐度計算Chao1、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù).實驗組和對照組的各樣本的覆蓋度均大于99%，說明本次測序所檢測到的微生物物種能夠覆蓋樣本中大多數(shù)的物種，與Shannon指數(shù)稀釋曲線的結(jié)果一致.Chao1指數(shù)反映樣本中物種的豐度，即OTU的數(shù)量.Chao1值越大代表物種總數(shù)越多，表明豐富度越高.如圖2A，實驗組的Chao1指數(shù)為332.30，對照組的Chao1指數(shù)為493.38，實驗組的物種豐富度較對照組顯著降低(P＜0.01)，說明藏、漢肝硬化患者腸道微生物物種豐度有顯著差異.

Shannon和Simpson指數(shù)用于反映群落的多樣性，包括物種豐度和物種均勻度，Shannon越大和Simpson指數(shù)越小，樣品中的物種多樣性越高.結(jié)果顯示，實驗組的Shannon指數(shù)中值為5.15略低于對照組的5.98，但差異并不顯著(P=0.060).Simpson指數(shù)中值實驗組與對照組分別為0.936與0.949，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.632)(圖2B、C).

2.4 腸道菌群的結(jié)構(gòu)與優(yōu)勢菌群分析 與Ribosomal Database Project數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對以及物種注釋，在門和屬兩個分類層次下對各個樣品的物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計.在門水平下，兩組均以擬桿菌門和厚壁菌門的豐度最高，其中擬桿菌門對照組與實驗組豐度百分比分別占到61.76%和36.86%，實驗組顯著減少(P＜0.001)；厚壁菌門分別占到32.95%和48.24%，實驗組顯著增加(P＜0.01)；其次，豐度較高的是放線菌門對照組與實驗組分別是2.10%和6.62%，實驗組增加(P＜0.05).同樣豐度較高的變形菌門、梭桿菌門實驗組分別占比為3.09%和0.06%，對照組為8%和0.05%，但兩組比較差異均不顯著(P＞0.05)(圖3).

表1 一般情況及肝功對比

圖1 各樣本腸道菌群Shannon指數(shù)曲線.

在屬水平上，對照組和實驗組的top15優(yōu)勢菌主要有普氏菌屬_9、擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬_2、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、志賀氏埃希菌屬、假丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium、另枝菌屬、Subdoligranulum、擬普雷沃菌屬、長奈瑟氏菌.如圖4，實驗組與對照組的腸道微生物組成由明顯差異，普氏菌屬_9為對照組的主要優(yōu)勢菌，而實驗組的菌群組成更加復(fù)雜.與對照組相比，實驗組葡萄球菌、放線菌明顯減少，差異顯著(P＜0.01)；乳桿菌屬明顯增加，差異顯著(P＜0.01).

3 討論

肝臟與消化道毗鄰，因其特殊的解剖位置，可形成所謂的肝-腸軸，肝臟因此成為抵御抗原、細(xì)菌和細(xì)菌產(chǎn)物等的第一道防線.大量研究已充分證實在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為固有定植菌的減少，非固有定植菌的增多，其中以厭氧菌及革蘭氏陰性菌桿菌增多更為明顯[1-4].然而，腸道菌群失調(diào)與肝硬化之間是否存在因果關(guān)系及其具體病理生理機(jī)制目前仍不清楚.有研究推測腸道菌群失調(diào)可通過改變膽汁酸生成，增加腸道黏膜通透性，引起細(xì)菌移位及小腸細(xì)菌過度生長等等方式共同參與肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)病過程[5，6].如腸道菌群失調(diào)參與細(xì)菌移位、內(nèi)毒素血癥、甚至肝性腦病、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎等的發(fā)生.有研究報道證實肝性腦病患者中腸道微生物平衡失調(diào)可導(dǎo)致細(xì)菌抗原移位，從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，損傷宿主腸道黏膜屏障的抵御機(jī)制，參與門靜脈高壓、肝性腦病等的發(fā)病機(jī)制[5，7].還有研究發(fā)現(xiàn)隨著肝臟疾病惡化，肝硬化患者的腸道菌群也會隨之改變，其中微生物基因組中豐度較高的細(xì)菌種屬與疾病的嚴(yán)重性有明顯關(guān)系[8].

圖2 Alpha多樣性分析.A：兩組Chao1指數(shù)對比；B：兩組Shannon指數(shù)對比；C：兩組Simpson指數(shù)對比.

高通量Illumina測序可檢測不可人工培養(yǎng)的腸道細(xì)菌，測序快速且結(jié)果準(zhǔn)確度高，可全面反應(yīng)復(fù)雜樣品的微生物群落的組成，是目前微生物多樣性研究的重要技術(shù)手段之一[9].本研究采用該技術(shù)對16S rDNA的V4可變區(qū)進(jìn)行測序，首次開展藏族肝硬化人群腸道細(xì)菌菌落組成分析.研究對20例藏族肝硬化患者(實驗組)和16例漢族肝硬化患者(對照組)糞便樣本中微生物的多樣性和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步分析，Chao1指數(shù)在實驗組和對照組之間有顯著差異(P＜0.05)，說明種族會對肝硬化患者的微生物豐度產(chǎn)生影響，藏族肝硬化患者的微生物豐度相較于漢族肝硬化患者降低.物種豐度統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，在門水平上，兩組的微生物種類主要有擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、梭桿菌門，其中擬桿菌門在實驗組中顯著減少(P＜0.001)，而厚壁菌門和放線菌門在實驗組中增加(P＜0.01和P＜0.05)；在屬水平上，兩組的前15微生物種類主要有普氏菌屬_9、擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬_2、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬、志賀氏埃希菌屬、假丁酸弧菌屬、布勞特氏菌屬、Lachnoclostridium、另枝菌屬、Subdoligranulum、擬普雷沃菌屬、長奈瑟氏菌，其中葡萄球菌屬、放線菌屬在實驗組中顯著減少(P＜0.01)，乳桿菌屬顯著增加(P＜0.01).

實驗組中擬桿菌門和厚壁菌門豐度百分比的顯著改變將會對F/B值(厚壁菌門/擬桿菌門豐度比值)造成較大的影響，F(xiàn)/B是衡量腸道菌群失調(diào)的標(biāo)準(zhǔn)之一，F(xiàn)/B值的改變說明在藏族肝硬化患者和漢族肝硬化患者之間存在不同程度的腸道菌群失調(diào)，將會對肝硬化的進(jìn)一步發(fā)展以及并發(fā)癥的發(fā)生造成不同程度的影響[10].藏族人群世居青藏高原，獨特的環(huán)境氣候也使藏族人群形成了獨特的飲食習(xí)慣.在藏族人群的日常飲食中，肉類(例如牛肉、羊肉等)和發(fā)酵類食品(例如酸奶)為主要食材，而對于碳水化合物、蔬菜和水果的攝入較少[11].此外，也有報道表明人種所帶來的基因上的差異也是造成藏漢腸道微生物組成差異的原因之一[12].由此可見，了解藏族肝硬化患者的腸道微生物組成將是建立肝硬化個性化治療方案的重要基礎(chǔ)，有利于藏族肝硬化患者的治療及預(yù)后的改善.本研究利用16S rDNA測序技術(shù)初步探索了藏族肝硬化患者的腸道微生物組成特點，為進(jìn)一步了解藏族肝硬化患者的肝硬化的發(fā)展進(jìn)程奠定了基礎(chǔ)，同時為失代償性肝硬化的個性化治療及預(yù)后的改善提供方向.但基于本研究病例數(shù)較少，不可避免地存在偏倚，因此需要更多大樣本、多中心、多層次的隨機(jī)對照研究進(jìn)一步證實.

圖3 兩組腸道菌群門水平比較.

圖4 微生物種水平相對豐度統(tǒng)計分析實驗組(1-20)和對照組(A-P).Prevotella_9：普氏菌屬_9；Bacteroides：擬桿菌屬；Faecalibacterium：糞桿菌屬；Prevotella_2：普氏菌屬_2；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬；Streptococcus：鏈球菌屬；Escherichia_Shigella：志賀氏埃希菌屬；Pseudobutyrivibrio：假丁酸弧菌屬；Blautia：布勞特氏菌屬；Alistipes：另枝菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Dorea：長奈瑟氏菌.

文章亮點

實驗背景

肝硬化是我國最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一，而在藏區(qū)這一疾病的高發(fā)性尤為突出.大量研究已充分證實在肝硬化患者中明顯存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為固有定植菌的減少，非固有定植菌的增多.這為臨床防治肝硬化及并發(fā)癥提供了新的線索與思路.揭示肝硬化患者腸道菌群的特征，將有助于進(jìn)一步認(rèn)識腸道微生態(tài)與肝硬化的關(guān)系，必將推進(jìn)腸道微生態(tài)在肝硬化綜合治療中的地位.由于藏族人群所生活的環(huán)境和飲食習(xí)慣及構(gòu)成均不同于普通人群，這些因素均參與人體腸道微生態(tài)的形成，也必將導(dǎo)致藏族人群腸道菌群特征也不同于普通人群，因此很有必要專門針對藏族人群腸道菌群特征進(jìn)行針對性研究.然而目前針對藏族人群腸道菌群特征，特別是針對藏族肝硬化患者腸道菌群的研究，國內(nèi)國外均未見報道，亟待相關(guān)研究填補(bǔ)空白.因此本研究擬針對藏族肝硬化腸道微生態(tài)進(jìn)行針對性研究，旨在揭示藏族人群中腸道菌群特征與肝硬化及相關(guān)并發(fā)癥的關(guān)系.

實驗動機(jī)

進(jìn)一步認(rèn)識腸道微生態(tài)與肝硬化的關(guān)系，為臨床防治藏族肝硬化及并發(fā)癥提供新的線索與思路.

實驗?zāi)繕?biāo)

對比藏、漢族肝硬化患者腸道菌群的差異，探討可能的內(nèi)在聯(lián)系.

實驗方法

收集納入受試者新鮮糞便，迅速于-80 °C度冰箱保存，同時收集受試者臨床相關(guān)資料.16SRNA測序及數(shù)據(jù)分析(高通量測序)：(1)腸道微生物DNA提取；(2)熒光定量PCR反應(yīng)；(3)PCR產(chǎn)物凝膠電泳；(4)PCR產(chǎn)物混合及純化；(5)測序分析：將純化的PCR混合產(chǎn)物使用Illumina Miseq測序平臺行雙端測序，并根據(jù)測序結(jié)果行相應(yīng)的生物數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析.測序技術(shù)可以在不需要培養(yǎng)的條件下進(jìn)行混合細(xì)菌的鑒定，特別是一些目前還無法培養(yǎng)的細(xì)菌可通過測序分析，極大豐富了腸道微生物的數(shù)據(jù)庫.特別是高通量是測序技術(shù)，針對大樣本的研究，只要能夠提供滿足測序要求的DNA，就可以對樣本中可能存在的微生物進(jìn)行分析.

實驗結(jié)果

本研究達(dá)到了試驗?zāi)繕?biāo)，結(jié)果顯示實驗組的Chao1指數(shù)為332.30，對照組的Chao1指數(shù)為493.38，實驗組的物種豐富度較對照組顯著降低(P＜0.01)，說明藏、漢肝硬化患者腸道微生物物種豐度有顯著差異.在反映群落的多樣性的Shannon、Simpson指數(shù)上，兩組對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義.基于97%的相似性進(jìn)行物種注釋，對實驗組和對照組進(jìn)行微生物物種豐度及構(gòu)成比上，門水平上實驗組中擬桿菌門顯著減少(P＜0.001)，厚壁菌門和放線菌門在實驗組中增加(P＜0.01和P＜0.05)；在屬水平上，葡萄球菌屬、放線菌屬在實驗組中顯著減少(P＜0.01)，乳桿菌屬顯著增加(P＜0.01).說明藏、漢族肝硬化患者的腸道微生物腸道微生物構(gòu)成比存在著差異.上述發(fā)現(xiàn)，填補(bǔ)了目前有關(guān)藏族肝硬化患者腸道菌群特征的空白.

實驗結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)藏族肝硬化患者的腸道微生物豐度明顯低于漢族肝硬化患者，腸道微生物組成存在著差異.推測可能與高原環(huán)境、飲食習(xí)慣及基因差異等有關(guān).這些差異可能參與了肝硬化疾病的發(fā)展，如果能進(jìn)一步明確這些有差異的微生物的功能與代謝機(jī)制，闡明微生物與疾病的內(nèi)在聯(lián)系，可為肝硬化的個性化治療提供可行方案.

展望前景

本研究首次展現(xiàn)了藏族肝硬化患者的腸道微生物組成特點，下一步可探究微生物的功能與代謝機(jī)制，進(jìn)一步探討微生物與疾病的內(nèi)在聯(lián)系，為肝硬化的個性化治療，提供更詳實的理論基礎(chǔ)及可行方案.