楊慶華 李文道 和繼剛

摘要? ? 采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對藜麥蛋白提取液進行酶解制得抗氧化肽，通過單因素試驗篩選出最佳蛋白酶。以DPPH自由基清除率為指標，通過響應面試驗對酶解條件進行優(yōu)化，并采用HPLC法對酶解液進行氨基酸種類及含量的測定。結(jié)果表明，藜麥抗氧化肽的最佳制備工藝為木瓜蛋白酶、酶解pH值6.63、加酶量2.36%、酶解溫度58.44 ℃、酶解時間1.0 h。藜麥抗氧化肽中共含有18種氨基酸，其中絲氨酸的含量最高，為65.46%。

關鍵詞? ? 藜麥;抗氧化肽;酶解;響應面試驗;HPLC

中圖分類號? ? TS201.1? ? ? ? 文獻標識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2019）14-0230-03? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Abstract? ? The acid protease，alkali protease，papain and neutral protease were used to prepare antioxidant peptides from quinoa protein extract by enzymatic hydrolysis，and the best protease was screened by single factor test.The DPPH free radical scavenging rate was used to optimize the enzymatic hydrolysis conditions by response surface methodology，the amino acid kinds and contents of the enzymatic hydrolysate were also determined by HPLC.The results showed that the optimal preparation method of antioxidant peptides from quinoa were using papain，enzymatic hydrolysis pH 6.63，dosage of enzyme 2.36%，enzymatic hydrolysis temperature 58.44 ℃，and enzymatic hydrolysis time 60 min.The antioxidant peptides from quinoa contains 18 kinds of amino acids，and the content of serine is up to 65.46%.

Key words? ? quinoa;antioxidant peptides;enzyme hydrolysis;response surface methodology;HPLC

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）又名南美藜、藜谷等，是一種糧食作物，屬莧科，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈地區(qū)，種植歷史悠久[1-2]。我國西藏地區(qū)于1987年引進，現(xiàn)已在山西、甘肅、青海等地實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化種植[3]。藜麥含有多種營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)含量為12.9%～16.5%，高于傳統(tǒng)的谷物[4]。藜麥中氨基酸含量豐富，含有大多數(shù)谷物蛋白缺乏的賴氨酸和精氨酸[5]。藜麥中的黃酮和多酚含量較高，具有較強的抗氧化活性[6]，但目前對藜麥抗氧化肽的研究較少。相對于化學法水解蛋白質(zhì)，蛋白酶酶解法更加安全、快捷、無污染。馬永強等[7]采用木瓜蛋白酶對大豆蛋白進行酶解制得大豆小分子肽。于? 慧等[8]采用胃蛋白酶對龍須菜蛋白進行酶解，再通過響應面試驗來優(yōu)化龍須菜蛋白的酶解工藝，得出最佳制備條件。本研究以藜麥為原料提取藜麥蛋白，采用4種不同類型的蛋白酶對其進行酶解來制備藜麥抗氧化肽。同時，以DPPH自由基清除率為指標優(yōu)化蛋白酶酶解條件，并對藜麥抗氧化肽中包含氨基酸的種類及含量進行測定，以期為藜麥活性成分的應用提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 原料與試劑

藜麥，產(chǎn)地山西靜樂;酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶均購于合肥博美生物科技有限責任公司;DPPH購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司;無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀等其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2? ? 供試儀器

供試儀器有1260型高效液相色譜儀、DF-101S型數(shù)顯恒溫水浴鍋、AR1140型分析天平、TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機、UV-2550型紫外可見分光光度計、101A-1型電熱恒溫鼓風干燥箱。

1.3? ? 試驗方法

1.3.1? ? 藜麥蛋白的提取。將藜麥粉碎后過100目篩，采用95%乙醇，按料液比1∶50在室溫下連續(xù)反應12 h，烘干得脫脂藜麥粉。準確稱取2.00 g脫脂藜麥粉，按料液比1∶30加入去離子水，調(diào)節(jié)pH值為8.0，在35 ℃下反應1.5 h，離心取上清液，調(diào)節(jié)pH值至等電點3.5，靜置，再次離心，取沉淀物，烘干至恒重，得藜麥蛋白粉。

1.3.2? ? 藜麥抗氧化肽的制備及性能測定。配制5.0%的藜麥蛋白提取液，調(diào)節(jié)pH值至一定值，加入一定量的酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶或中性蛋白酶，在一定溫度下進行酶解，反應結(jié)束后，置于沸水中滅酶15 min，待冷卻后調(diào)節(jié)pH值為3.5，離心取上清液冷凍干燥，得藜麥抗氧化肽。取一定量的藜麥抗氧化肽溶于水，滴加適量現(xiàn)配的0.1 mmol/L DPPH溶液，以無水乙醇作為參比，計算DPPH自由基清除率[9]。

1.3.3? ? 藜麥抗氧化肽中氨基酸組成及含量的測定。采用篩選出的最佳蛋白酶對藜麥蛋白進行酶解反應，得相應的藜麥蛋白酶酶解液，對其進行氨基酸的衍生化反應，置于80 ℃水浴中加熱，避光反應1 h，待冷卻后用磷酸緩沖溶液調(diào)其pH值為7.0，定容，經(jīng)0.45 μm有機相濾膜過濾后進行HPLC分析[10]。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 制備藜麥抗氧化肽最佳蛋白酶的選擇

采用酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶對藜麥蛋白提取液進行酶解，通過單因素試驗考察了酶解pH值、加酶量、酶解溫度和酶解時間這4個反應條件對DPPH自由基清除率的影響，從而確定出4種蛋白酶的最佳反應條件。結(jié)果表明，4種蛋白酶的最佳酶解條件分別為酸性蛋白酶pH值3.0，加酶量4.0%，溫度35 ℃，時間1.0 h;堿性蛋白酶pH值9.0，加酶量3.0%，溫度55 ℃，時間2.0 h;木瓜蛋白酶pH值6.5，加酶量2.0%，溫度55 ℃，時間1.0 h;中性蛋白酶pH值7.0，加酶量2.0%，溫度35 ℃，時間1.5 h。

在4種蛋白酶的最佳反應條件下對藜麥蛋白提取液進行酶解，并對蛋白酶酶解液進行抗氧化活性的測定，結(jié)果如圖1所示。可以看出，在這4種蛋白酶中，木瓜蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率最高，達到了91.73%;堿性蛋白酶次之;中性蛋白酶最低。因此，本試驗采用木瓜蛋白酶對藜麥蛋白進行酶解來制備藜麥抗氧化肽。

2.2? ? 響應面試驗優(yōu)化酶解條件

2.2.1? ? 響應面優(yōu)化的試驗設計與結(jié)果。在木瓜蛋白酶的單因素試驗中，對DPPH自由基清除率影響最顯著的3個因素為pH值、酶解溫度和加酶量，為進一步優(yōu)化藜麥抗氧化肽的制備工藝，進行響應面試驗。固定酶解時間1.0 h，探究pH值（A）、酶解溫度（B）和加酶量（C）對DPPH自由基清除率（Y）的影響（表1），采用Design-Expert系統(tǒng)Box-Behnken試驗設計，進行3因素3水平的響應面試驗，結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0.6.0軟件對表2中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得二次多項回歸模型方程：Y=92.81+5.62A+0.63B+5.35C-1.75AB-2.45AC+3.51BC-6.32A2-3.90B2-4.08C2。

2.2.2? ? 響應面回歸模型方程的方差分析。為了檢驗回歸模型方程的有效性，進一步確定各因素對藜麥抗氧化肽性能的影響，對回歸模型進行了方差分析，結(jié)果見表3?？梢钥闯觯貧w模型的F值為86.4，P值<0.01，模型極顯著;失擬項的P值為0.1532>0.05，失擬不顯著。表明該模型擬合度較好，可靠性高，回歸模型能較好地分析3個因素與響應值之間的關系，試驗辦法具有可行性?；貧w模型中F（A）=216.96，F(xiàn)（B）=2.71，F(xiàn)（C）=196.71，說明各因素對DPPH自由基清除率的影響順序為pH值>加酶量>溫度。此外，回歸模型方程中一次項A、C，交互項AC、BC和二次項A2、B2、C2對DPPH自由基清除率的影響極顯著（P值<0.01）;回歸模型方程中交互項AB對DPPH自由基清除率的影響顯著（P值<0.05）;回歸模型方程中一次項B對DPPH自由基清除率的影響不顯著。

2.2.3? ? DPPH自由基清除率的響應面分析。由圖2可以看出，pH值、溫度和加酶量的交互作用對DPPH自由基清除率的影響均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，存在極大值。由圖1（a）可知，溫度一定時，DPPH自由基清除率隨著pH值的增加而增大;當pH值一定時，DPPH自由基清除率隨著溫度的增加而增大。由圖1（b）可知，加酶量一定時，DPPH自由基清除率隨著pH值的增加而增大;當pH值一定時，DPPH自由基清除率隨著加酶量的增加而增大。由圖1（c）可知，當加酶量一定時，溫度對DPPH自由基清除率的結(jié)果影響不大;當溫度一定時，加酶量對DPPH自由基清除率的結(jié)果亦影響不大。

綜合考慮pH值、溫度和加酶量對DPPH自由基清除率的影響，通過響應面試驗優(yōu)化得到藜麥抗氧化肽的最佳制備工藝為酶解pH值6.63、加酶量2.36%、酶解溫度58.44 ℃、酶解時間1.0 h，此時DPPH自由基清除率為95.66%。

2.3? ? HPLC法測定結(jié)果分析

采用木瓜蛋白酶在最佳制備工藝下對藜麥蛋白提取液進行酶解，通過HPLC法對藜麥抗氧化肽中氨基酸的組成及含量進行測定，結(jié)果見表4?？梢钥闯?，采用木瓜蛋白酶酶解制備的藜麥抗氧化肽中氨基酸種類豐富，共含有18種氨基酸，其中絲氨酸的含量最高，為65.46%;甲硫氨酸含量次之，為8.06%;甘氨酸含量最低，為0.43%。此外，藜麥抗氧化肽還包含大多數(shù)谷物蛋白所缺乏的賴氨酸和精氨酸，含量分別為3.34%和3.23%。

3? ? 結(jié)論

在酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的最佳酶解條件下，木瓜蛋白酶酶解液的DPPH自由基清除率最高。通過響應面試驗分析，得到各因素對DPPH自由基清除率的影響順序為pH值>加酶量>溫度;藜麥抗氧化肽的最佳制備工藝為酶解pH值6.63、加酶量2.36%、酶解溫度58.44 ℃、酶解時間1.0 h，此時DPPH自由基清除率高達95.66%。通過HPLC法測定出藜麥抗氧化肽中共含有18種氨基酸，其中絲氨酸的含量最高，甘氨酸含量最低。

4? ? 參考文獻

[1] GRAF B L，ROJASSILVA P，ROJO L E，et al.Innovations in health value and functional food development of quinoa（Chenopodium quinoa Willd.）[J].Comprehensive Reviews in Food Science & Food Safety，2015，14（4）：431-445.

[2] 闕淼森，蔣玉蓉，曹美麗，等.響應面試驗優(yōu)化藜麥種子多酚提取工藝及其品種差異[J].食品科學，2016，37（4）：7-12.

[3] 任貴興，楊修仕，么楊.中國藜麥產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀[J].作物雜志，2015（5）：1-5.

[4] MAHONEY A W，LOPEZ J G，HENDRICKS D G.An evaluation of the protein quality of Quinoa[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry，1975，23（2）：190-193.

[5] 孫雪婷，蔣玉蓉，袁俊杰，等.響應面法優(yōu)化提取藜麥種子黃酮及抗氧化活性[J].中國食品學報，2017，17（3）：127-135.

[6] ABDERRAHIM F，HUANATICO E，SEGURA R，et al.Physical features，phenolic compounds，betalains and total antioxidant capacity of coloured quinoa seeds（Chenopodium quinoa Willd.）from peruvian altiplano[J].Food Chemistry，2015，183：83-90.

[7] 馬永強，趙毅，石彥國.大豆蛋白水解物中肽分子分布的研究[J].中國糧油學報，2001，16（3）：15-17.

[8] 于慧，劉海梅，李蒙娜，等.響應面法優(yōu)化龍須菜蛋白酶解工藝及酶解液的抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技，2017，38（12）：157-163.

[9] 鄺高波，黃和.番石榴多酚體外抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（2）：111-115.

[10] 劉世凱.籽粒莧籽蛋白和多酚物質(zhì)的提取及性質(zhì)研究[D].天津：天津商業(yè)大學，2011：12.