衛(wèi)紅萍， 李冰新

1.陽泉師范高等專科學(xué)校，山西 陽泉 045000；2.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山西 臨汾 041000

0 引言

馬鈴薯青枯病由茄科雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)感染引起[1].該菌使細(xì)菌病原體枯萎，是世界上最具破壞性的植物病害之一，是一個(gè)高度多樣化的細(xì)菌植物病原體[2].青枯病的病原菌可危害許多茄科經(jīng)濟(jì)作物，其嚴(yán)重性已引起各個(gè)地區(qū)不同國家的重視[3].青枯菌分布狀況復(fù)雜，近幾年來，國內(nèi)外對(duì)其研究很多.特別是分子生物學(xué)家提出種系型基礎(chǔ)為親緣關(guān)系的體系劃分，為病理學(xué)者和育種工作者進(jìn)一步研究提供了依據(jù)[4].

抗壞血酸(AsA)在植物生理過程中作抗氧化劑，它保護(hù)自由基，減少逆境脅迫，延緩衰老，又是許多酶的生長調(diào)節(jié)因子及其輔助因子[5].能夠參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控生長發(fā)育，抗壞血酸的量與植物抗逆性之間有正相關(guān)的關(guān)系[6].不但在植物許多生理過程中發(fā)揮作用，如生長發(fā)育、分化、防衛(wèi)等,而且和細(xì)胞伸長緊密聯(lián)系.抗壞血酸出現(xiàn)于植物的各個(gè)階段，還會(huì)影響氧化還原以及病原反應(yīng)[7].抗壞血酸還有助于維持人類及動(dòng)物正常發(fā)育生長[5].在強(qiáng)光下GGPase活性會(huì)提高，但GDP-甘露糖途徑其他酶活性改變不大[7].GDP-L-半乳糖磷酸化酶(GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase)參與ASA合成，對(duì)于在逆境條件下調(diào)節(jié)其濃度有重要作用[8].目前GGPase基因已在多種植物中分離，轉(zhuǎn)基因研究發(fā)現(xiàn)，許多物種中GGPase基因上調(diào)會(huì)增加植物體抗壞血酸量[7].

最新的前人研究結(jié)果表明GDP-l-半乳糖磷酸化酶通過抗壞血酸生物合成的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)植物對(duì)脅迫的誘導(dǎo)的快速應(yīng)激反應(yīng)[9].而本實(shí)驗(yàn)室前期工作中獲得一條EST，該EST是在馬鈴薯與青枯菌互作過程中獲得的馬鈴薯上調(diào)表達(dá)EST，實(shí)驗(yàn)室前期工作推斷出該EST參與青枯病對(duì)青枯病的抗性，認(rèn)為其可能參與了由青枯菌引發(fā)的脅迫的誘導(dǎo)的快速應(yīng)激反應(yīng).本論文從該EST出發(fā)，主要對(duì)Solanumtuberosum的GDP-L-半乳糖磷酸化酶類1基因EST序列進(jìn)行生物信息學(xué)的分析.

1 材料與方法

1.1 研究材料

研究對(duì)象是青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶類1基因，論文來自本實(shí)驗(yàn)室前期工作中選取的一條EST，懷疑其參與青枯病抗性.本論文從該EST出發(fā)，進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析，為其后續(xù)功能研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1.2 核酸序列分析

用BLAST程序核酸序列分析、同源序列對(duì)比，應(yīng)用Bioedit[10]軟件進(jìn)行堿基含量分析等參考李卉等[11～14].

1.3 氨基酸序列分析

用BioEdit作氨基酸組成、NetPhos Server[15]分析磷酸化位點(diǎn)、Expasy-Protscale[16]分析疏水性、TMHMM Server v. 2.0分析膜穿透性、SignalP 4.1 server[17]分析信號(hào)肽及結(jié)構(gòu)分析[11～14].

1.4 亞細(xì)胞位點(diǎn)及功能位點(diǎn)預(yù)測

用softberry[18]、CPHmodels 3.2 Sever[19]、DS visualizer對(duì)其亞細(xì)胞位點(diǎn)及功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測.

1.5 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

運(yùn)用MEGA 5.0.5[20]軟件建系統(tǒng)發(fā)生樹.

2 結(jié)果與分析

2.1 核酸序列基本分析

運(yùn)用BioEdit軟件分析目標(biāo)基因序列的組成，測序的結(jié)果如表1：本核苷酸序列全長1 742 bp，單鏈分子量528 271.00 Daltons，雙鏈分子量1 058 062.00 Daltons.四種堿基的含量分別為A：25.66 %；C：22.90 %；G：23.94 %；T： 27.50 %；G+C含量為 46.84 %；A+T含量為53.16 %.該核苷酸序列中T含量最高，C含量最少.

表1 核苷酸組成Tab.1 Nucleotide composition

使用NCBI上的BLAST工具包進(jìn)行堿基的初步同源性分析，結(jié)果顯示：該核苷酸序列高度保守，經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)是一條同源性相似度在99 %的馬鈴薯GDP-L-半乳糖磷酸化酶類1序列.

2.2 氨基酸序列的理化性質(zhì)初步分析

2.2.1 氨基酸序列的組成分析

表2 氨基酸的組成Tab.2 Composition of amino acids

運(yùn)用Bioedit軟件分析目標(biāo)氨基酸的組成，結(jié)果如表2顯示:該蛋白質(zhì)的氨基酸的個(gè)數(shù)為357個(gè).其中含量最多的是天冬酰胺(Asn)占161個(gè)，Asn是占比最大的，為45.10 %；其次是纈氨酸(Val)，甘氨酸(Gly)，丙氨酸(Ala)，這三種氨基酸含量各占比為7.56 %，7.28 %，7.00 %；最少的是色氨酸(Trp)，僅占0.56 %.極性帶正電荷的氨基酸殘基(Lys，Arg，His)的總數(shù)為41；極性帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp)的總數(shù)為16.

2.2.2 磷酸化位點(diǎn)的分析

利用NetPhos 3.1 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)分子磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測分析[15]，如圖1所示：共發(fā)現(xiàn)有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中13個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)Tyr磷酸化位點(diǎn)，可能被酸化.

圖1 磷酸化位點(diǎn)圖Fig.1 Phosphorylation site

2.2.3 氨基酸分子的親、疏水性分析

利用ExPAsy 數(shù)據(jù)庫的ProtScale服務(wù)器[16]分析氨基酸與水結(jié)合的性質(zhì)，結(jié)果如圖2顯示：此氨基酸序列的疏水性和親水性氨基酸，在整個(gè)肽鏈當(dāng)中呈極不均勻分布；疏水性氨基酸很明顯的少于親水性的氨基酸.在第100個(gè)～150個(gè)氨基酸之間出現(xiàn)親水性最大值，親水性在此區(qū)間較高；在第200個(gè)～250個(gè)氨基酸之間出現(xiàn)疏水性最大值，疏水性在此區(qū)間比較高.由此可知，該序列所編碼的蛋白質(zhì)有較強(qiáng)的親水性，為水溶性蛋白質(zhì)，由此推導(dǎo)出該氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu)可能是非球狀分子.

圖2 氨基酸結(jié)合水性圖Fig.2 Amino acid binding water

2.2.4 蛋白質(zhì)分子的膜穿透性、信號(hào)肽區(qū)域分析

利用TMHMM Server v. 2.0進(jìn)行蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)分析[12]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得到的蛋白可能為膜外蛋白且無跨膜區(qū)的存在.采用丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器的SignalP 4.1 Server[21]軟件，對(duì)蛋白質(zhì)的信號(hào)肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該條氨基酸序列沒有信號(hào)肽(Signal peptide)出現(xiàn).

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用PBILLYON-GERLAND信息庫在線二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測服務(wù)器對(duì)馬鈴薯EST基因氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖3.可以看出，156個(gè)氨基酸可形成無規(guī)則卷曲(Cc)，占氨基酸總數(shù)的43.70 %；94個(gè)氨基酸可形成α-螺旋(He)，占氨基酸總數(shù)的26.33 %；79個(gè)氨基酸可形成延伸鏈(Ee)，占氨基酸總數(shù)的22.13 %.它們?cè)谡麠l肽鏈中呈間隔分布，延伸鏈在肽鏈中分布相對(duì)較少.由上預(yù)測該蛋白質(zhì)由四種結(jié)構(gòu)形式組成二級(jí)結(jié)構(gòu).

圖3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測
Fig.3 Secondary structure prediction

h:α-螺旋；e:延伸鏈；c:無規(guī)則卷曲

Alpha helix(Hh):46 32.17 %(圖中最長豎線) Extended strand(Ee):26 18.18 %

(圖中最短豎線) Randon coil(Cc):71 49.65 %(圖中中長豎線)

2.4 蛋白分子亞細(xì)胞位點(diǎn)預(yù)測

利用TargetP1.I Server和WOLF PSORT服務(wù)器聯(lián)合進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞預(yù)測分析，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞位點(diǎn)可能位于細(xì)胞外.

2.5 氨基酸序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)研究

由圖4可推知：該氨基酸序列的三級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成.

2.6 建系統(tǒng)的發(fā)生樹

利用NCBI上的BLAST工具包尋找氨基酸序列的同源序列，并使用MEGA 5.0.5軟件構(gòu)建N-L法系統(tǒng)進(jìn)化樹[20].如圖5所示：進(jìn)化樹顯示目標(biāo)序列與番茄GDP-L-半乳糖磷酸化酶屬于同一分支.氨基酸序列總體上比較保守.

圖4 三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖
Fig.4 Three-level structural model

圖5 M-L法建的系統(tǒng)樹圖
Fig.5 The phylogenetic tree built by M-L

3 討論

3.1 核酸序列初步的分析顯示該基因?yàn)镚DP-L-半乳糖磷酸化酶類似物

來源于本實(shí)驗(yàn)前期工作[13，14，22～24]的這條序列從以上若干方面的分析，得出：此序列全長1 742bp，含酶切位點(diǎn)，可進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn).通過堿基的同源性分析，與SolanumtuberosumGDP-L-galactose phosphorylase 1-like序列差距不大為0﹪，因此可確定該條序列是SolanumtuberosumGDP-L-galactose phosphorylase 1-like.該 EST可能是GDP-L-半乳糖磷酸化酶類似物基因.

3.2 GDP-L-半乳糖磷酸化酶類似物可能參與馬鈴薯青枯病抗性的表達(dá)

左曉宇等人在研究陸地棉 GDP-L-半乳糖磷酸化酶基因啟動(dòng)子的克隆及活性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸對(duì)于植物響應(yīng)逆境脅迫和發(fā)育過程十分重要[6].GDP-L-半乳糖磷酸化酶參與AsA 合成[25]，由干旱脅迫所誘導(dǎo)產(chǎn)生.初步推測其與馬鈴薯抗青枯菌引發(fā)的青枯病有關(guān)[11～14].最新的前人研究結(jié)果表明GDP-1-半乳糖磷酸化酶通過抗壞血酸生物合成的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)植物對(duì)脅迫包括病原菌脅迫的誘導(dǎo)的快速應(yīng)激反應(yīng)[26]，而本實(shí)驗(yàn)所用EST是青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯應(yīng)答反應(yīng)中克隆到的上調(diào)表達(dá)基因.

3.3 該基因產(chǎn)物可能的生理功能

該氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)有十一個(gè)功能域，結(jié)構(gòu)決定功能，N-糖基化的免疫逃避和在病毒發(fā)病機(jī)理中的作用十分重要[27].異戊烯基側(cè)鏈有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和不同結(jié)構(gòu)類型，它們所具有的生物活性各不一樣，異戊烯基側(cè)鏈其結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)類型和生物活性有很大聯(lián)系[28].

因此，我們可以這些相關(guān)性質(zhì)為參考，對(duì)GDP-L-半乳糖磷酸化酶類1基因的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行預(yù)測，綜合分析該基因可能在馬鈴薯青枯病抗性表現(xiàn)中起到某種作用.在以上工作的基礎(chǔ)上，下一步的工作可以進(jìn)行以下操作：進(jìn)行GO分析[29]，進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析[30]，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RACE克隆，還可以進(jìn)行基因表達(dá)分析如激發(fā)子誘導(dǎo)[23，24]、轉(zhuǎn)基因過表達(dá)分析[20]等來分析基因功能.