余 瀟，辛培堯，尹亞梅，楊自云，鄧?yán)蛱m

(1.西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.國家林業(yè)局西南風(fēng)景園林工程研究中心，云南 昆明 650224； 3.西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，云南 昆明 650224； 4.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

千果欖仁(Terminaliamyriocarpa)和小葉欖仁(Terminalianeotaliala)均為使君子科(Combretaceae)訶子屬(Terminalia)植物。千果欖仁在我國主要分布于廣西(龍津)、云南(中部至南部)和西藏(墨脫)，是我國二級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，按IUCN地方瀕危等級標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)屬于“瀕危種(EN)”[1]。小葉欖仁原產(chǎn)非洲的馬達(dá)加斯加，我國的云南、廣西、廣東、福建、臺灣等熱帶地區(qū)已有栽培。對欖仁屬植物的染色體核型的研究目前尚處于空白狀態(tài)，開展其研究一方面可為2種植物的育種研究提供參考，另一方面也可為屬間和種間的進(jìn)化關(guān)系以及生物的系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考[2]。

1 材料和方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所需千果欖仁種子來自于云南省鎮(zhèn)沅縣境內(nèi)的哀牢山國家級自然保護(hù)區(qū)及瑞麗市境內(nèi)的銅璧關(guān)自然保護(hù)區(qū)，小葉欖仁種子來自于云南省鎮(zhèn)沅縣。種子采收去除雜質(zhì)后在西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院云南省園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行育苗。

1.2 方法

染色體制片技術(shù)采用李懋學(xué)等[3-4]提出的方法。

1.2.1 取樣 待千果欖仁和小葉欖仁幼根長至1～1.5 cm時(shí)，于9∶00—10∶00時(shí)進(jìn)行取材，選擇生長健壯的白色根尖。

1.2.2 預(yù)處理 千果欖仁預(yù)處理：預(yù)處理試劑為飽和對二氯苯溶液，將根尖浸泡在飽和對二氯苯溶液，置于4 ℃冰箱中1.5 h。 小葉欖仁預(yù)處理：預(yù)處理試劑為飽和對二氯苯溶液，將根尖浸泡在飽和對二氯苯溶液，置于4 ℃冰箱中1 h。

1.2.3 固定 千果欖仁固定：將經(jīng)過預(yù)處理后的根尖取出轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，現(xiàn)配)，放入4 ℃冰箱中固定45 min。小葉欖仁固定：將經(jīng)過預(yù)處理后的根尖取出轉(zhuǎn)入卡諾氏固定液(無水乙醇∶冰醋酸=3∶1，現(xiàn)配)，放入4 ℃冰箱中固定30 min。

1.2.4 解離 千果欖仁解離：取出固定好的根尖，放入蒸餾水中浸泡10 min，解離液用1 mol·L-1鹽酸和45%醋酸按1∶1比例在60 ℃水浴鍋中預(yù)熱6 min，將根尖放入解離液中解離15 min，取出用蒸餾水多次沖洗[5-9]，洗除材料殘留的解離液。小葉欖仁解離：取出固定好的根尖，放入蒸餾水中浸泡10 min，解離液用1 N鹽酸在60 ℃水浴鍋中預(yù)熱6 min，將根尖放入解離液中解離10 min，取出用蒸餾水多次沖洗，洗除材料殘留的解離液。

1.2.5 染色制片 將解離好的根尖置于潔凈的載玻片中央，用刀片切下0.1 cm左右的呈透明狀的根尖，滴加1～2滴醋酸地衣紅染液進(jìn)行染色2 min左右，用濾紙吸取多余染液，迅速蓋上蓋玻片，然后小木棍輕輕敲打蓋玻片，使細(xì)胞分散和展開[5]。

1.2.6 鏡檢 用日本OlympusBX51顯微鏡進(jìn)行觀察，選取50個(gè)細(xì)胞染色體分散均勻、分裂相較好、染色體完整、著絲點(diǎn)及輪廓清晰、各條染色體處于同一平面的中期細(xì)胞，并進(jìn)行顯微照相測量及統(tǒng)計(jì)。

本實(shí)驗(yàn)染色體核型分析采用Levana等[10-11]標(biāo)準(zhǔn)劃分，核型類型根據(jù)Stebbins[12]的研究依據(jù)劃分，植物染色體標(biāo)準(zhǔn)化分析采用李懋學(xué)等[13]方法。使用OPTPRO2008數(shù)碼顯微鏡圖像分析處理系統(tǒng)中的測量工具測量染色體長度。

2 結(jié)果與分析

通過對千果欖仁和小葉欖仁染色體數(shù)目進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)，確定兩者的染色體數(shù)目均為24條，未發(fā)現(xiàn)非整倍性變異，因此可以確定千果欖仁和小葉欖仁體細(xì)胞染色體數(shù)目為2n=2x=24，基數(shù)為x=12的二倍體(表1、圖1、圖2)。

表1 千果欖仁和小葉欖仁染色體參數(shù)

表1(續(xù))

*：表中染色體相對長度系數(shù)(I、R、L)根據(jù)染色體長度/全組染色體平均長度的比值判斷，其標(biāo)準(zhǔn)為：I、R、L<0.76，短染色體(S)；0.76126，長染色體(L)。根據(jù)臂比值大小，可將染色體分為4種類型：1.0<臂比值≤1.70，中部著絲粒染色體(M)；1.71<臂比值≤3.00，亞中部著絲粒染色體(SM)；3.01<臂比值≤7.00，亞端部著絲粒染色體(ST)；7.01<臂比值≤∞，端部著絲粒染色體(T)。

千果欖仁的染色體相對長度范圍在6.04～10.80 μm，全組染色體平均相對長度為8.3325 μm。最長染色體與最短染色體之比是1.79∶1，染色體相對長度系數(shù)范圍為0.72～1.30，按Kuo等[14]的方法，1號為長染色體(L)，2～6號為中長染色體(M2)，7～11號為中短染色體(M1)，12號為短染色體(S)，故千果欖仁的相對長度組成為2n=2L+10M2+10M1+2S。著絲點(diǎn)位置與臂比值方面，臂比范圍在1.11～2.04，平均臂比為1.48，著絲點(diǎn)指數(shù)范圍在32.95%～47.31%，9號、11號、12號染色體的臂比為近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，臂比值變化范圍為1.72～2.04，其余為中部著絲點(diǎn)染色體(m)，臂比值變化范圍為1.11～1.44，都在1.01～1.70的范圍內(nèi)，所以千果欖仁的核型公式為2n=2x=24=18m+6sm，未發(fā)現(xiàn)具有隨體染色體。千果欖仁染色體組染色體總長為99.99 μm，長臂總長為58.82 μm，根據(jù)Arano[15]的計(jì)算方法，核型不對稱系數(shù)(AS.K%)為58.83%。千果欖仁的臂比值除12號染色體在2～4范圍內(nèi)，占染色體總數(shù)的8.33%，其余均小于2，核型屬于“2A”型。根據(jù)千果欖仁染色體的長短和形態(tài)特征進(jìn)行同源染色體配對，得到染色體核型圖(圖1)。根據(jù)表1中所列各染色體的相對長度平均值，用Excel 2007制作繪制核型模式圖(圖2)。

小葉欖仁的染色體相對長度范圍在6.66～10.25 μm，全組染色體平均相對長度為8.335 μm。最長染色體與最短染色體之比是1.54∶1，染色體相對長度系數(shù)范圍為0.80～1.23，按Kuo等[14]的方法，1～6號為中長染色體(M2)，7～12號為中短染色體(M1)，故小葉欖仁的相對長度組成為2n=12M2+12M1。著絲點(diǎn)位置與臂比值方面，臂比范圍在1.38～1.69，平均臂比為1.45，著絲點(diǎn)指數(shù)范圍在37.18%～41.92%，除7號為近中部著絲點(diǎn)染色體(sm)，臂比值為1.69，其余均為中部著絲點(diǎn)染色體(m)，臂比值變化范圍為1.38～1.48，都在1.01～1.70的范圍內(nèi)，所以小葉欖仁的核型公式為2n=2x=24=22m+2sm，未發(fā)現(xiàn)具有隨體染色體。小葉欖仁染色體組染色體總長為100.02 μm，長臂總長為59.15 μm，根據(jù)Arano[16]的計(jì)算方法，核型不對稱系數(shù)(AS.K%)為59.14%。小葉欖仁的所有染色體臂比值均小于2的，核型屬于“1A”型。根據(jù)小葉欖仁染色體的長短和形態(tài)特征進(jìn)行同源染色體配對，得到染色體核型圖(圖1)。根據(jù)表1中所列各染色體的相對長度平均值，用Excel 2007制作繪制核型模式圖(圖2)。

圖1 千果欖仁和小葉欖仁中期染色體形態(tài)及其核型圖

圖2 千果欖仁和小葉欖仁核型模式圖

3 結(jié)論與討論

關(guān)于千果欖仁根尖細(xì)胞(RTC)進(jìn)行染色體試驗(yàn)觀察，關(guān)鍵是要獲得分散較好的中期細(xì)胞。本試驗(yàn)在根尖預(yù)處理過程中對飽和對二氯苯、秋水仙素、8-羥基奎啉溶液的預(yù)處理效果做了比較，發(fā)現(xiàn)使用飽和對二氯苯預(yù)處理千果欖仁根尖，獲得了分散良好、完整的中期染色體分裂相，效果好于其它2種預(yù)處理液。究其原因，主要是因?yàn)閷Χ缺阶饔糜诖笕旧w的植物比處理小染色體植物的分裂相效果更好[8]。秋水仙素的預(yù)處理效果常受其濃度及處理溫度的影響。而在解離過程中，解離時(shí)間也是能否獲得滿意的分裂相的關(guān)鍵之一，對于千果欖仁根尖細(xì)胞的處理時(shí)間應(yīng)控制在6 min左右，具體的準(zhǔn)確時(shí)間還需要根據(jù)試驗(yàn)條件微調(diào)，解離時(shí)間如果過短，細(xì)胞壁沒有被打破，導(dǎo)致無法觀察；解離時(shí)間如果過長，則會導(dǎo)致細(xì)胞過于松散甚至破碎，從而導(dǎo)致染色體過于分散無法確定這些染色體是否屬于同一細(xì)胞。

在千果欖仁的核型分析中，沒有發(fā)現(xiàn)隨體染色體，其原因可能是在預(yù)處理過程中次縊痕區(qū)或者是核仁組織區(qū)的染色體高度濃縮導(dǎo)致與長短臂粘合而導(dǎo)致次縊痕消失[16]，從而導(dǎo)致在試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)染色體隨體，也有可能是由于千果欖仁染色體根本就沒有帶隨體的特征。千果欖仁染色體有無隨體的問題還有待進(jìn)一步觀察研究。