高飛，胡澤斌，孫楠，段然慧，游延軍，左甜甜，夏昆，黃杰

脆性X綜合征外周血淋巴細(xì)胞永生化細(xì)胞系的建立與驗(yàn)證

高飛*，胡澤斌*，孫楠，段然慧，游延軍，左甜甜，夏昆，黃杰

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室（高飛、胡澤斌、孫楠、黃杰），中藥民族藥檢定所天然藥物室（左甜甜）；410078 長(zhǎng)沙，中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究中心（段然慧、夏昆）；611731 成都，四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院（游延軍）

脆性 X 綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是一種 X 連鎖不完全外顯性遺傳病，是引起遺傳性智力低下和孤獨(dú)癥譜系障礙最常見的單基因病[1]，因細(xì)胞中 X 染色體末端在特殊培養(yǎng)基中經(jīng)誘變劑作用后可顯示如同斷裂的脆性部位而得名。男性患者多見且癥狀較重，表現(xiàn)為智力低下、巨睪、特殊面容、語言行為障礙等；女性攜帶者約 1/3 表現(xiàn)出智力低下或其他癥狀。95% ~ 99% 的 FXS 患者是由1基因 5'UTR CGG 重復(fù)擴(kuò)增的動(dòng)態(tài)突變和異常甲基化導(dǎo)致1 基因轉(zhuǎn)錄沉默、FMRP 蛋白合成減少或丟失所致。正常人群中 CGG 重復(fù)數(shù)目在 5 ~ 44 之間，最常見的重復(fù)數(shù)目為 29 或 30；CGG 重復(fù)數(shù)目在 45 ~ 54 之間時(shí)稱為灰區(qū)（中間型），該等位基因亦屬正常范圍；傳遞過程中可發(fā)生小尺寸的重復(fù)數(shù)目增加或減少，一代內(nèi)不會(huì)擴(kuò)增至全突變，但可在更遠(yuǎn)的世代傳遞中擴(kuò)增為全突變，從而導(dǎo)致發(fā)病。前突變（premutation，PM）CGG 重復(fù)數(shù)目在 55 ~ 200 之間，無FXS 患病表現(xiàn)；全突變（full mutation，F(xiàn)M）CGG 重復(fù)擴(kuò)增至 200 以上，部分重復(fù)數(shù)目達(dá)幾百甚至上千，F(xiàn)XS 特征表現(xiàn)明顯[2]。具體的1基因突變類型與發(fā)病關(guān)系如圖 1 所示。

圖 1 FMR1基因型與發(fā)病關(guān)系[3]

1995 年至今，我國共對(duì) 12 676 例智力低下患兒進(jìn)行了脆性 X 綜合征的篩查，查出患兒共計(jì) 804 例，以此計(jì)算出脆性 X 綜合征在我國智力低下患兒中的患病率約為 6.3%[4]。鑒于該遺傳病患者生活不能自理、發(fā)病率較高且樣本獲得困難的特點(diǎn)，對(duì)臨床樣本的永生化細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化和有效檢測(cè)方法的建立至關(guān)重要，可以為脆性 X 遺傳病和分子生物學(xué)研究提供長(zhǎng)期穩(wěn)定的遺傳資源。目前國內(nèi)相關(guān)的研究，特別是脆性 X 綜合征永生化細(xì)胞系建立的報(bào)道較少。本研究的驗(yàn)證方法采用熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法和 Southern blot 法，Southern 印跡雜交是目前最主要的脆性 X 確診方法[5]，可診斷出全突變患者和 CGG 異常擴(kuò)增次數(shù)較多的前突變攜帶者，但對(duì)擴(kuò)增次數(shù)較少的前突變攜帶者或嵌合體攜帶者可能存在漏檢。因此采用熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法和Southern blot 法相結(jié)合的檢測(cè)方法可保證驗(yàn)證結(jié)果的全面及準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 取經(jīng)在中南大學(xué)家輝遺傳醫(yī)院確診患者的外周血 5 ml。患者均簽署知情同意書。樣本信息詳見表 1。

表 1 10 例樣本信息

1.1.2 試劑和耗材 核酸提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；永生化細(xì)胞系建立所需試劑購自美國 Gibco 公司；參考品驗(yàn)證所需試劑盒購自廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司和北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司；NanoDrop 核酸蛋白測(cè)定儀為安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 EBV 病毒液的制備 利用饑餓后的病毒細(xì)胞準(zhǔn)備新鮮病毒液，RPMI1640 + 1× 雙抗，復(fù)蘇 1 株 B95-8 細(xì)胞株，接種于5 ml 20% FBS 和 80% RPMI1640 的培養(yǎng)基中，每隔 2 ~ 3 天補(bǔ)液一次，逐漸增加培養(yǎng)液到所需的用量，饑餓細(xì)胞 4 ~ 7 d 后，收集細(xì)胞在液氮及 37 ℃條件下反復(fù)凍融 3 次，2000 r/min 離心 10 min。取上清液用 0.2 μm 濾膜過濾后短暫放置于 4 ℃冰箱，最終于–70 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脆性 X 綜合征患者淋巴細(xì)胞的分離 使用肝素抗凝管盛裝患者及親屬的外周靜脈全血 5 ml，將血液轉(zhuǎn)移到 Corning 離心管后加入 4 ml Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液，加入等體積的含有青霉素及鏈霉素的 RPMI1640 培養(yǎng)液，2500 r/min 離心 30 min 后移取白色絮狀淋巴細(xì)胞至另一試管中，加入8 ml RPMI1640 洗滌 2 次，800 r/min 離心 10 min 備用。

1.2.3 脆性 X 綜合征患者淋巴細(xì)胞的永生化轉(zhuǎn)化 將分離出的細(xì)胞用 8 ml RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌 2 次后，在800 r/min 條件下離心10 min 去上清，加入 EBV病毒液1.5 ml，環(huán)孢菌素 A 0.4 ml（200 μg/ml 母液，最終作用濃度 2 μg/ml），混勻后等份轉(zhuǎn)入 2 個(gè) 10 ml 培養(yǎng)瓶中，置于 37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24 ~ 48 h 后，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況并拍照，根據(jù)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和聚集情況進(jìn)行加液或半量換液，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到（3 ~ 6）× 106個(gè)/ml 時(shí)將細(xì)胞吹勻，1500 r/min 離心 5 min 后用凍存液重懸并置于凍存管中凍存。

1.2.4 脆性 X 綜合征患者永生化細(xì)胞系的凍存 在細(xì)胞株凍存前 24 h 換液；將細(xì)胞培養(yǎng)物收集至 10 ml 離心管中，1200 r/min 離心 10 min，棄上清，根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量加入一定量的凍存液（30% 胎牛血清、70% RPMI1640、10% 二甲基亞砜，過濾滅菌，–20 ℃避光保存），分裝在凍存管中，每管1 ml 凍存液，置–20 ℃ 2 h 后置于–70 ℃，2 h 后放入液氮中保存。

1.2.5 脆性 X 綜合征患者永生化細(xì)胞系的分子生物學(xué)檢驗(yàn) 將脆性 X 綜合征患者永生化細(xì)胞系取出復(fù)蘇后進(jìn)行 DNA 提取，再進(jìn)行熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法和 Southern blot 法的驗(yàn)證檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 脆性 X 綜合征患者淋巴細(xì)胞的永生化轉(zhuǎn)化顯微鏡驗(yàn)證結(jié)果

10 份細(xì)胞株樣本在復(fù)蘇并培養(yǎng) 7 d 時(shí)，在倒置顯微鏡下可觀察到光滑透亮的淋巴細(xì)胞明顯發(fā)生增大、聚團(tuán)，且細(xì)胞周邊有較多的胞質(zhì)突出（圖 2）；30 d 時(shí)，顯微鏡下可觀察到淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)形成密集的細(xì)胞團(tuán)且外壁有不規(guī)則毛刺狀突起（圖 3），表明細(xì)胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞樣 B 細(xì)胞，表明轉(zhuǎn)化成功。

2.2 脆性 X 綜合征患者永生化細(xì)胞系分子生物學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

將 10 份永生化細(xì)胞株樣本用核酸提取試劑盒進(jìn)行 DNA 抽提，提取的 DNA 用NanoDrop 核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定260/280和260/230值并用瓊脂糖凝膠電泳膠檢驗(yàn) DNA 的完整性，NanoDropTMOne 對(duì) DNA 進(jìn)行精確定量；對(duì) DNA 樣本進(jìn)行熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法及Southern blot 法檢驗(yàn)分析，分析結(jié)果顯示全部陽性樣本的堿基序列與樣本 CGG 重復(fù)數(shù)一致。檢測(cè)結(jié)果見表 2、圖 4、圖 5。

圖 2 永生化細(xì)胞系轉(zhuǎn)化第 7 天結(jié)果（40 ×）

圖 3 永生化細(xì)胞系轉(zhuǎn)化第 30 天結(jié)果（100 ×）

表 2 10 份脆性 X 樣本永生化細(xì)胞系驗(yàn)證結(jié)果

注：該 10 份脆性 X 永生化細(xì)胞系樣本為建系成功后液氮凍存的樣本。

圖 4 10 份脆性 X 樣本永生化細(xì)胞系熒光 PCR-毛細(xì)管電泳法結(jié)果

圖 5 10 份脆性 X 樣本永生化細(xì)胞系 Southern blot 法結(jié)果

3 討論

建立具有人類全基因組的永生化淋巴細(xì)胞系，是人類重要疾病遺傳資源保存與收集的主要技術(shù)手段和首選方法[6]。目前世界上具有較大影響力的基因細(xì)胞遺傳資源存儲(chǔ)機(jī)構(gòu)包括英國生物樣本庫（The UK Biobank）、美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）和美國國家人類基因細(xì)胞庫（The NIGMS Human Genetic Cell Repository），它們均是以永生化淋巴細(xì)胞系作為最主要的技術(shù)方法保存細(xì)胞遺傳資源[7]。建立永生化淋巴細(xì)胞系的優(yōu)點(diǎn)明顯：樣本用量較少，由 EBV 轉(zhuǎn)化外周血 B 淋巴細(xì)胞建立永生細(xì)胞株的方法規(guī)范[8]；連續(xù)培養(yǎng)傳代過程中染色體穩(wěn)定；細(xì)胞建系和培養(yǎng)成本較低；重要的是可獲得取之不盡的細(xì)胞遺傳資源用于遺傳性疾病的研究[9]。

本研究采用經(jīng)肝素抗凝的脆性 X 綜合征各突變類型的外周全血樣本，通過反復(fù)研究采用了（1 ~ 5）× 105個(gè)/ml 低密度接種轉(zhuǎn)化細(xì)胞，減少了 T、B 細(xì)胞的接觸機(jī)會(huì)；加入環(huán)孢素 A（終濃度 1 μg/ml）抑制了 T 細(xì)胞活性，最終成功建立了脆性 X 綜合征各類型樣本的外周血永生化細(xì)胞系，且成功進(jìn)行了傳代、凍存和復(fù)蘇。同時(shí)對(duì)建系成功的永生化細(xì)胞株進(jìn)行了可精確讀取 CGG 重復(fù)數(shù)量的熒光 PCR-毛細(xì)管電泳和脆性 X 檢測(cè)經(jīng)典方法的 Southern blot 法驗(yàn)證，結(jié)果表明脆性 X 基因組 DNA 遺傳穩(wěn)定，可作為寶貴的樣本資源，為檢測(cè)試劑盒生產(chǎn)企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制及后續(xù)的脆性 X 綜合征臨床檢驗(yàn)與疾病控制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

[1] Garber KB, Visootsak J, Warren ST. Fragile X syndrome. Eur J Hum Genet, 2008, 16(6):666-672.

[2] Monaghan KG, Lyon E, Spector EB, et al. ACMG Standards and Guidelines for fragile X testing: a revision to the disease-specific supplements to the Standards and Guidelines for Clinical Genetics Laboratories of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genet Med, 2013, 15(7):575-586.

[3] Li Y, Jin P. RNA-mediated neurodegeneration in fragile X-associated tremor/ataxia syndrome. Brain Res, 2012, 1462:112-117.

[4] Yu L, Duan RH. Screening for fragile X syndrome in people with mental retardation and autism. Chin J Med Genet, 2015, 32(4):593- 596. (in Chinese)

于莉, 段然惠. 智力低下和孤獨(dú)癥等人群中脆性X綜合征的篩查. 中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 2015, 32(4):593-596.

[5] Huang W, Luo S, Ou J, et al. Correlation between FMR1 expression and and clinical phenotype in discordant discordant dichorionic-diamniotic monozygotic twin sisters with the fragile X mutation. J Med Genet, 2014, 51(3):159-164.

[6] Wang DJ, Li ND, Han RF. Establishment of immortalized cell lines for genetic eye diseases. Recent Adv Ophthalmol, 2014, 34(12): 1114-1117. (in Chinese)

王冬杰, 李寧東, 韓瑞芳. 遺傳眼病永生化細(xì)胞系建立方法. 眼科新進(jìn)展, 2014, 34(12):1114-1117.

[7] Zhao XH, Qian YM. Biobank -- the foundation of personalized medicine. Translational Med J, 2014, 3(2):69-73, 83. (in Chinese)

趙曉航, 錢陽明. 生物樣本庫——個(gè)體化醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ). 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)雜志, 2014, 3(2):69-73, 83.

[8] Hagerman R, Hoem G, Hagerman P. Fragile X and autism: intertwined at the molecular level leading to targeted treatments. Mol Autism, 2010, 1(1):12.

[9] Chen DP, Zeng SF, Zhang SZ. Study on X chromosome fragile site and FMR1 gene mutation in children with metal retardation. Chin J Birth Health Hered, 2014, 22(1):32, 132. (in Chinese)

陳冬萍, 曾素芬, 張素貞. 智力低下兒童X染色體脆性位點(diǎn)及FMR1基因突變的研究. 中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2014, 22(1):32, 132.

*同為第一作者

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.015

中國食品藥品檢定研究院中青年發(fā)展研究基金（2017C1）

黃杰，Email：jhuang5522@126.com；夏昆，Email：xiakun@ sklmg.edu.cn

2019-08-13