黃際薇，姜彩云，羅宇燕，郭喆霏，張永明

(中山大學附屬第三醫(yī)院藥劑科，廣東 廣州 510630)

人體內(nèi)存在大量豐富的紅細胞，紅細胞作為藥物輸送的載體已經(jīng)被人們廣泛研究[1]。它具備許多優(yōu)勢使得其成為優(yōu)良的藥物輸送載體，如良好的生物相容性、超長的體內(nèi)循環(huán)時間、可以延緩藥物的釋放等[2]。但是由于紅細胞的活動范圍僅限于血管內(nèi)部，使得其眾多的優(yōu)良特性在治療中存在一定的局限性[3]。為此，近年來采用天然紅細胞膜作為外殼來包載合成的納米粒內(nèi)核，使其偽裝成內(nèi)源性物質(zhì)，制備得到核殼結(jié)構(gòu)的紅細胞膜納米載體，能夠減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取和免疫識別[4-5]。本研究制備紅細胞膜仿生納米粒(red blood cell membranes biomimetic nanoparticles，RBCM-NP)，具有紅細胞膜(red blood cell membranes，RBCM)作為藥物輸送的優(yōu)點，提高藥物穩(wěn)定性[6]。本研究通過調(diào)整擠壓次數(shù)、納米粒與紅細胞膜的比例來制備不同處方的RBCM-NP，優(yōu)化處方紅細胞膜能夠完全包裹住納米粒，構(gòu)建一個新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系。

1 材料與儀器

1.1 試劑與動物

聚乙二醇-聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PEG2000-PLGA3.8萬，濟南岱罡生物工程有限公司)；50～60 d SPF級SD雄性大鼠(120～140 g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心，SCXK(粵)2013-0002)；生物素化PEG-PLGA(Biotin-PEG2000-PLGA3.8萬，廈門研科生物技術(shù)有限公司)；鏈霉親和素(streptavidin，ST)(S9170，北京索萊寶)；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

SL16/40 ( R) 冷凍離心機 (美國Thermo公司)；92SM-202A電子天平(瑞士Precisa公司)；Mastersizer 2000 激光粒度儀 (英國馬爾文儀器有限公司)；透射電子顯微鏡(日本Jeol Jem-1230)。

2 方 法

2.1 NP體系的構(gòu)建

采用反溶劑法制得NP：PEG-PLGA 25 mg溶于2.5 mL丙酮，逐滴加入5 mL泊洛沙姆溶液(w=0.25%)中，減壓除去有機溶劑，超濾管離心收集，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer，PB)中再分散，即得空白NP。

2.2 NP體系的表征

2.2.1 粒徑和Zeta電位 取上述制備所得的NP于室溫下用粒度測定儀測定粒徑和Zeta電位。

2.2.2 透射電鏡表征NP的形態(tài) 測試樣品滴至透射電鏡專用銅網(wǎng)，孵育后濾紙吸去殘留液體，再用2 g/L磷鎢酸染色液染色。

2.2.3 穩(wěn)定性 NP分散在4 ℃ PB中，形成5 mg/mL的質(zhì)量濃度于0，3 ，9 d測定NP的粒徑。

2.3 RBCM-NP體系的構(gòu)建

2.3.1 RBCM的制備 制備紅細胞懸液: 取大鼠腹主動脈血，收集血液，離心，525 r/min×20 min×4 ℃；吸棄血漿和白膜層。等滲 PB(300 mOsm/L)洗3次，等體積300 mOsm/L PB重懸制成紅細胞懸液備用。溶血：取2 mL紅細胞懸液加至28 mL低滲PB (20 mOsm/L)；混勻后離心，10 500 r/min×40 min×4 ℃； 棄上清，重復上述操作3次，得RBCM。

2.3.2 RBCM-NP的構(gòu)建 采用脂質(zhì)體擠壓法，將RBCM使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過400 nm孔徑的膜，21次。將制備好的RBCM與NP進行混合，使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過200 nm孔徑的膜數(shù)次，得到RBCM-NP。

2.4 RBCM-NP的表征

2.4.1 粒徑和Zeta電位 取上述制備所得的RBCM-NP用粒度測定儀測定粒徑和Zeta電位。

2.4.2 RBCM覆蓋程度 生物素化納米粒(biotinylated nanoparticle， BTNP)，制備方法見2.1。RBCM仿生BTNP(red cell membranes biomimetic biotinylated nanoparticle，RBCM-BTNP)，制備方法見2.3。利用BTNP與ST孵育會發(fā)生聚集反應來研究紅細胞膜的覆蓋程度。BTNP和RBCM-BTNP分別與ST孵育30 min后，檢測BTNP和RBCM-BTNP的粒徑。

3 結(jié) 果

3.1 NP的表征

采用反溶劑法制得NP，重復性良好，粒徑分布均一，為(101.80 ± 2.55) nm，Zeta電位為((-12.87)±(-0.25)) mV，多分散指數(shù)為0.045。檢測NP在0，3 ，9 d的粒徑變化情況，沒有顯著性差異(見圖1和圖2)。

圖1 NP粒徑分布圖Fig.1 Diameter distribution of NP

圖2 NP的粒徑變化 (NP分散在PB中，于0，3，9 d測定NP的粒徑，n=3)Fig.2 Changes of size of NP(NP are dispersed in PB, and the diameter size is measured at 0 , 3 and 9 d, n=3)

3.2 RBCM-NP的處方優(yōu)化

采用脂質(zhì)體擠壓法，制備RBCM-BTNP，在透射電鏡下能夠發(fā)現(xiàn)外周包裹了一層膜結(jié)構(gòu)，而單獨NP是沒有的(見圖3)。

圖3 NP和RBCM-NP的透射電鏡圖(A: NP；B: RBCM-NP)Fig.3 TEM of NP and RBCM-NP(A: NP；B: RBCM-NP)

為了進一步優(yōu)化處方，按照不同配比采用脂質(zhì)體擠壓法制備不同處方的RBCM-NP。取不同體積的血液提取RBCM，最終用0.5 mL的等滲PB稀釋備用，采用脂質(zhì)體擠壓法，將0.5 mL RBCM溶液使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過400 nm孔徑的膜，21次。同時取不同濃度的NP溶液0.1 mL，將制備好的的RBCM與NP進行混合，再使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過200 nm孔徑的膜數(shù)次，具體配比參照表1進行制備。

表1 不同處方制備紅細胞膜納米粒Table 1 RBCM-NP by different prescriptions

在電鏡的視野下，處方1和處方2視野相對比較清晰。處方4視野比較雜亂，散亂的細胞膜比較多(見圖4)。同時檢測了四個處方的Zeta電位，Zeta電位的絕對值越高說明該處方越穩(wěn)定，相對于處方1，處方4的Zeta電位的絕對值較高(P< 0.05)，處方2和處方3較低(P< 0.01)，見圖5。結(jié)合上述結(jié)果，處方1相對其他處方較好。處方1制備的RBCM-NP，粒徑分布均一(粒徑：(110.8 ± 2.29) nm， Zeta電位：((-18.87)±(-0.67)) mV，多分散指數(shù)：0.048)，為優(yōu)化處方(見圖6)。

圖4 不同處方的RBCM-NP的透射電鏡圖(A：處方1；B：處方2；C：處方3；D：處方4；細箭頭代表RBCM-NP；粗箭頭代表RBCM)Fig.4 TEM of RBCM-NP by different formulations(A: formulation 1; B: formulation 2; C: formulation 3; D: formulation 4； the thin arrows represent RBCM-NP；the bold arrows represent RBCM)

按照優(yōu)化處方制備了RBCM-NP和NP，RBCM-NP的Zeta電位明顯高于NP(P< 0.01)，見圖7。

圖5 不同處方RBCM-NP的Zeta電位(相對于處方1，*P < 0.05，**P < 0.01；n=3)Fig.5 Zeta potential of RBCM-NP by different formulations (The significant differences are compared to prescription 1, at *P < 0.05, and **P< 0.01; n=3)

圖6 RBCM-NP(處方1)粒徑分布圖Fig.6 Diameter distribution of RBCM-NP by formulation 1

圖7 優(yōu)化處方(處方1)制備RBCM-NP和NP的Zeta電位(相對于NP，**P < 0.01，n=3)Fig.7 Zeta potential of RBCM-NP by formulation 1 (The significant differences are compared to NP, at **P < 0.01; n=3)

3.3 RBCM-NP包載程度的研究

BTNP和按照處方1制備的RBCM-BTNP分別與ST孵育30 min后，分別檢測粒徑。孵育前后RBCM-BTNP的粒徑?jīng)]有顯著性差異，孵育前后BTNP的粒徑有顯著性差異(P< 0.01)見圖8、圖9。

圖8 優(yōu)化處方(處方1)制備RBCM-BTNP和BTNP分別與ST孵育前后的粒徑(RBCM-BTNP + ST，BTNP + ST分別代表RBCM-BTNP孵育后和BTNP孵育后；相對于BTNP，**P < 0.01;n=3)Fig.8 The sizes of RBCM-BTNP and BTNP by formulation 1 before and after incubation with ST (RBCM-BTNP + ST：RBCM-BTNP after incubation；BTNP + ST：BTNP after incubation；the significant differences are compared to BTNP, at **P < 0.01; n=3)

圖9 RBCM-BTNP(優(yōu)化處方：處方1)和BTNP分別與ST孵育前后的粒徑分布圖(1:BTNP 孵育前;2:RBCM-BTNP 孵育前;3:RBCM-BTNP 與ST孵育后;4:BTNP 與ST孵育后)Fig.9 Diameter distribution of RBCM-BTNP and BTNP by formulation 1 before and after incubation with ST (1 : RBCM-BTNP before incubation; 2 : RBCM-BTNP before incubation; 3 : RBCM-BTNP after incubation with ST; 4 : BTNP after incubation with ST)

4 討 論

本研究構(gòu)建一個新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系。本研究采用反溶劑法制得PEG-PLGA的NP粒徑分布均一，穩(wěn)定性好。近年來以PLGA等相關(guān)材料作為載體制得的NP在具有良好生物相容性的同時，更能實現(xiàn)藥物的可控釋放，延長藥物的作用時間，減少給藥次數(shù)，降低藥物的毒副作用，改善患者的依從性和治療效果。然而，NP的表面電荷粒徑、形狀都可影響其被單核-巨噬細胞攝取[7-8]，導致全身給藥時到達作用組織的藥量減少。

近年來，細胞膜仿生納米粒在生物與醫(yī)學領(lǐng)域得到了極大的關(guān)注。采用天然細胞膜作為外殼來包載合成的納米粒內(nèi)核，使其偽裝成內(nèi)源性物質(zhì)，不僅減少網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取[5]，而且能減少免疫識別[9]。 細胞膜的結(jié)構(gòu)與功能，尤其是細胞膜表面的特異性功能蛋白得以保留，得到的細胞膜納米粒具有合成納米材料的高度可調(diào)的物理化學性質(zhì)，及宿主細胞膜的高度復雜的功能，制備工藝也相對簡單。此外，雙層膜結(jié)構(gòu)的包載為跨膜蛋白的錨定提供了絕佳的場所，使制備功能強大的仿生納米粒成為可能[10]。本研究采用脂質(zhì)體擠壓法將RBCM使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過400 nm孔徑的膜，21次。將制備好的RBCM與NP進行混合，再使用脂質(zhì)體擠壓器擠壓過200 nm孔徑的膜數(shù)次，成功制備了RBCM-NP，在透射電鏡下，可以發(fā)現(xiàn)與NP相比，RBCM-NP外周包裹一層膜結(jié)構(gòu)。

為了進一步優(yōu)化RBCM-NP，我們改變了RBCM與NP的配比和最后擠出次數(shù)，通過透射電鏡拍攝4個不同的處方。處方4由于擠出次數(shù)變多，使細胞膜受到多次沖擊，導致細胞膜的破碎，因此處方4視野比較雜亂。處方1為優(yōu)化處方制備的RBCM-NP粒徑分布均一，同時包載了RBCM的NP要比沒有膜結(jié)構(gòu)的NP更穩(wěn)定。處方3由于納米粒濃度增加，部分納米粒沒有完全被細胞膜包裹，因此處方3的Zeta電位較低，穩(wěn)定性較差。

本研究構(gòu)建一個新型的藥物遞送系統(tǒng)——RBCM-NP遞藥體系，NP和RBCM-NP粒徑均一，優(yōu)化處方RBCM能夠完全包裹住NP，重現(xiàn)性良好，為后期仿生納米粒的研究提供了理論基礎(chǔ)。