安 靜 古麗斯坦 宋 斌2 姜 娜 富昕純 周曉龍

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量與檢測技術(shù)研究所,烏魯木齊 830091；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241)

呋喃唑酮(Furazolidone)屬于硝基呋喃類藥物，具有良好的抗菌作用，主要用于水生動物的細菌性疾病防治，曾被廣泛用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖[1]。雖然呋喃唑酮在動物體內(nèi)的半衰期極短，但呋喃唑酮代謝物3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)能夠與體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，并以結(jié)合物的形式長期存在機體內(nèi)[2]。相關(guān)研究表明AOZ蛋白結(jié)合物在胃部等酸性環(huán)境易被釋放，從而對動物機體造成致癌、致畸、致突變等毒害作用[3]。鑒于上述風險，1995年，歐盟禁止呋喃唑酮在畜禽、水產(chǎn)動物食品中使用[4]；2002年，韓國《食品公典》中規(guī)定豬肉中不得檢出呋喃唑酮，同年我國頒布禁止使用硝基呋喃類抗生素的禁令，殘留限量為1μg/kg[5]。但是，由于硝基呋喃類藥物價格低廉、抗菌效果良好，在水生動物養(yǎng)殖中仍被違規(guī)使用，嚴重影響食品安全質(zhì)量和對外水產(chǎn)品的貿(mào)易出口，提示了加強呋喃唑酮等硝基呋喃類藥物的食品安全監(jiān)管、提升呋喃唑酮殘留檢測水平的現(xiàn)實需求。

目前，呋喃唑酮代謝物殘留檢測的方法主要有HPLC、酶聯(lián)免疫吸附法等，其中HPLC檢測結(jié)果精準可靠，但操作流程繁瑣、技術(shù)要求高，而酶聯(lián)免疫吸附法操作簡便、檢測快捷，且具有較高的特異性和靈敏性[6-8]。本研究通過建立AOZ-CLIA方法，可在短時間內(nèi)完成AOZ殘留檢測，并聯(lián)合HPLC同時檢測新疆羅非魚樣品，展現(xiàn)出較好的準確性和可靠性，適用于基層大規(guī)模水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物殘留檢測。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

AOZ購自Witega公司；AOZ單克隆抗體由上海獸醫(yī)研究所提供；N-羥基琥珀酰亞胺購自Aldrich公司，辣根過氧化物(HRP)購自上海雪滿生物科技有限公司；N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N,N’-二甲基甲酰胺(DMF)、對醛基苯甲酸和對醛基苯甲醛均購自北京博時立華生物科技有限公司；化學(xué)發(fā)光底液購自Biopanda公司。

1.2 酶標記物CPAOZ-HRP制備

1.2.1CPAOZ合成

將DMF滴加至400μL濃度為0.04g/mL的對醛基苯甲酸溶液，待對醛基苯甲酸完全溶解后，加入0.025gAOZ，室溫反應(yīng)3h，有黃色沉淀生成后，抽濾水洗3次，烘干得到CPAOZ。

1.2.2CPAOZ-HRP制備

將2.5mgCPAOZ溶于0.25mLDMF，分別加入1.80mgNHS，3.0mgDCC，充分混勻，制備成混合A液；將2.0mgHRP溶于1mL碳酸鹽緩沖液，制備成混合B液。取0.2mL混合A液加入混合B液，室溫攪拌3h，置于4℃過夜反應(yīng)，而后用PBS透析3d。透析完畢，加入等體積的甘油保存液，保存于-20℃。

1.3 酶標記物的鑒定

使用220～500nm紫外光掃描檢測CPAOZ、HRP和CPZAO-HRP，測定最大吸收波長的吸光度，比較3個物質(zhì)特征吸收峰，判斷酶標記物是否偶聯(lián)成功。

1.4 AOZ-CLIA方法建立

1.4.1最佳抗體包被濃度和酶標記物濃度的測定

將AOZ抗體和酶標記物梯度稀釋，AOZ抗體分別縱向包被化學(xué)發(fā)光板，酶標記物橫向加入，37℃反應(yīng)2h，洗滌3次后，加入化學(xué)發(fā)光滴液，采用發(fā)光檢測儀檢測，讀取化學(xué)發(fā)光值(CPS)，選擇CPS在1X106的抗體包被濃度和酶標記物濃度為最佳濃度。

1.4.2檢測步驟

采用最佳抗體包被濃度的AOZ抗體包被化學(xué)發(fā)光板，用10g/L明膠溶液封閉，洗滌后，加入50μL NPAOZ(AOZ的對硝基苯甲醛衍生物)標準液或備測溶液，然后加入50uLHRP，震蕩混勻，37℃反應(yīng)2h，洗滌3次，加入化學(xué)發(fā)光底液，檢測讀取CPS。

1.4.3特異性測定

將AOZ和其他硝基呋喃類藥物代謝標志物AMOZ、SEM、AHD，以及其他水產(chǎn)品養(yǎng)殖中禁用藥物作為競爭抑制物，進行直接競爭CLIA，測定各競爭抑制物的IC50，計算各競爭物對AOZ單克隆抗體的交叉反應(yīng)率(反應(yīng)率計算公式：AOZ的IC50/抑制物的IC50×100%)。

1.4.4最低檢出限測定

運用CLIA法測定20個空白樣品(20μL PBS+20μL酶標物)和20個空白羅非魚樣品提取液。計算空白樣品和空白羅非魚樣品的CPS平均值和標準差。運用公式Z=X-3SD，根據(jù)標準曲線計算Z值對應(yīng)的4-NPAOZ濃度，即為最低檢出限。

1.4.5回收試驗

取HPLC檢測的陰性樣品作為空白樣品，在羅非魚肉空白樣品中添加AOZ至終濃度0.5、1、2μg/kg，每個濃度設(shè)5個平行。采用CLIA法測定樣品中AOZ濃度，并計算回收率和變異系數(shù)?；厥章使?(實測濃度平均值/添加濃度)×100%，變異系數(shù)=(實測濃度偏差/實測濃度平均值)× 100%。

1.5 市售樣品檢測

采集新疆某市5個農(nóng)貿(mào)市場的羅非魚樣品15份。用AOZ-CLIA法、HPLC檢測15份市售樣品和2份陰性、6份陽性對照，每個樣品重復(fù)2次，檢測結(jié)果取平均值，分析兩種方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 酶標記物鑒定

220～500nm紫外光掃描檢測CPAOZ、HRP和CPZAO-HRP，CPAOZ最大吸收波長為275nm，HRP最大吸收波長分別為262nm和403nm，CPZAO-HRP最大吸收波長分別為290nm和403nm，結(jié)果顯示酶標記物偶聯(lián)成功(圖1)。

圖1 CPAOZ、HRP和CPAOZ-HRP紫外掃描圖

2.2 AOZ-CLIA方法的建立和優(yōu)化

2.2.1最佳抗體包被濃度和酶標記物濃度的確定

通過棋盤法選擇1x106CPS值附近的抗體包被濃度和酶標記物為最佳濃度，分別為1∶6000和1∶64000。詳見表1。

表1 不同抗體包被濃度和酶標記物濃度下的CPS值(n× 106)

2.2.2CLISA標準曲線的建立

NPAOZ在線性范圍0.0527～8.5ng/mL之間，相對吸光值與NPAOZ濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，回歸方程為y=-0.249x+0.325,R2=0.995,IC50為0.235ng/mL(圖2)。

圖2 NPAOZ-CLIA標準曲線

2.2.3特異性測定

AOZ單克隆抗體與NPAOZ、AOZ交叉反應(yīng)率分別為100%和0.21%，與同類抗生素、同類抗生素代謝物未發(fā)生交叉反應(yīng)，表明AOZ抗體特異性較高。詳見表2。

2.2.4最低檢出限測定

根據(jù)20個空白樣品和20個空白羅非魚樣品的平均值X和標準差SD，計算4-NPAOZ標準溶液的最低檢出限為0.0509ug/kg。詳見表3。

表2 AOZ單克隆抗體與硝基呋喃類抗生素、水產(chǎn)品中常用禁藥的交叉反應(yīng)率

表3 最低檢出限測定結(jié)果

樣品類型CPS值1234567891011121314151617181920XSD空白樣品297890301525295408297100289659305407298152289965298715304892285962297108310107298526301472285979302651287571285475302560296806.27020.27空白羅非魚樣品265085274320299857283512243107256715271205263217249878295137269580276940289659271852276565265840281952274560281259279813273502.6513676.197

2.2.5樣品添加回收試驗

AOZ的添加范圍分別為0.5μg/kg、1μg/kg和2μg/kg ，用CLIA方法測定AOZ回收率在87.2%～95.0%，檢測值的變異系數(shù)≤10%。詳見表4。

表4 添加回收率和變異系數(shù)

2.3 實際樣品檢測

2份陰性對照和15份市售樣品的AOZ-CLIA、HPLC檢測值均小于0.02ng/g；6份陽性對照檢測結(jié)果見表5。繪制陽性對照的HPLC和AOZ-CLIA標準曲線，兩種方法呈線性相關(guān)y= -0.872x+0.429，R2=0.996，結(jié)果見圖3。

表5 實際樣品檢測結(jié)果

圖3 AOZ-CLIA和HPLC檢測結(jié)果相關(guān)性分析

3 討論

AOZ是小分子半抗原，不具有免疫原性，需要與大分子蛋白載體偶聯(lián)合成人工抗原，才能獲得免疫原性，進而誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答[9]。AOZ和AMOZ、SEM等硝基呋喃類藥物代謝產(chǎn)物的分子質(zhì)量較小，且分子空間結(jié)構(gòu)簡單，如果直接偶聯(lián)大分子蛋白質(zhì)，很難獲得特異性高的抗體，因此在偶聯(lián)過程中，需要對半抗原進行衍生修飾[10,11]，本研究借鑒王民燕等研究[12]，選擇醛基苯甲酸作為衍生劑，一方面是其可以與代謝物和大分子蛋白載體結(jié)合，另一方面其具有的苯環(huán)結(jié)構(gòu)可提高單抗制備的成功率。此外，為了有效提升酶標記物與免疫原的結(jié)合，降低兩者偶聯(lián)過程中的結(jié)構(gòu)差異，實驗先將AOZ與對醛基苯甲酸進行反應(yīng)，生成CPAOZ，并引入羧基，再通過與HRP偶聯(lián)生成酶標記物CPAOZ-HRP，紫外光譜鑒定表明酶標記物偶聯(lián)成功。

基于單克隆抗體的免疫學(xué)方法，一般具有特異性強、效價高的特點[13]。本實驗采用自制備AOZ單克隆抗體建立CLIA檢測方法，結(jié)果顯示AOZ單抗與硝基呋喃類其他藥物及其代謝產(chǎn)物無交叉反應(yīng)，表明了CLIA方法具有較高的特異性。與此同時，本實驗建立的AOZ直接競爭CLIA檢測方法展現(xiàn)出較高的靈敏度，其IC50為0.235ng/mL，且CLIA方法在檢測羅非魚樣品的最低檢出限為0.0509ug/kg，比我國硝基呋喃類藥物代謝物限定值，以及歐盟規(guī)定的最大殘留量(1ug/kg)均低，表明了該檢測方法可以滿足我國和歐盟的檢測要求

目前，采用免疫學(xué)原理進行藥物殘留檢測的方法主要有兩種[14]，一種是直接競爭法，其首先將特異性抗體吸附于固相載體，而后加入酶標記物和待測樣品，通過底物顯色，定量分析待測樣本中的靶藥物含量，該方法的優(yōu)點是操作簡單、步驟少，檢測時間短。另一種是間接競爭法，通過靶藥物的完全抗原吸附于固相載體，加入經(jīng)前處理的待測樣品和抗靶藥物的單克隆抗體，而后加入酶標二抗，再與底物顯色反應(yīng)，測定待測樣品中的靶藥物含量，該方法相較于第一種方法，其靈敏度更高，但操作較為繁瑣、檢測時間較長。本研究建立的CLIA方法屬直接競爭法，其靈敏度雖然要低于間接競爭法，但該方法的最低檢出限仍低于我國和歐盟的最大殘留量。

本研究運用AOZ-CLIA法和HPLC法對新疆市售的羅非魚樣本進行檢測，結(jié)果顯示所有市售樣品均未檢出超標樣本，且兩種方法的檢測結(jié)果呈線性相關(guān)。HPLC法作為藥物殘留檢測的金標準，其檢測結(jié)果精準可靠[15,16]，而本研究建立的AOZ-CLIA法與HPLC法檢測結(jié)果高度相關(guān)，表明前者具有極高的準確度。此外，15份新疆市售羅非魚樣本均符合呋喃唑酮類藥物的限量要求，表明近年來新疆通過行政監(jiān)管、市場監(jiān)督和監(jiān)測常態(tài)化，有效限制了水產(chǎn)行業(yè)對呋喃唑酮類藥物的使用。

綜上所述，AOZ-CLIA靈敏度高、特異性強，且操作簡便，用時較短，適合于監(jiān)測現(xiàn)場和大批量樣本的初篩檢測，值得基層推廣應(yīng)用。