張姝, 李紅, 馮連順 編寫 劉明亮, 郭慧元 審校

(1 武漢譜尼科技有限公司，武漢 430014;2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 100050）

1 前言

自第一個(gè)喹諾酮——萘啶酸于1963年被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)用于治療細(xì)菌感染，尤其是上世紀(jì)80年代初Koga等結(jié)合吡哌酸和氟甲喹的結(jié)構(gòu)特征成功開發(fā)出喹諾酮發(fā)展史上具有劃時(shí)代意義的6-氟-7-哌嗪基取代的首個(gè)氟喹諾酮——諾氟沙星以來，這類藥物的發(fā)展日新月異，抗菌譜和藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)等得到顯著改善，更具特點(diǎn)的新品種不斷問世。氟喹諾酮可通過與細(xì)菌DNA促旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶IV催化結(jié)構(gòu)域中的喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)鍵來干擾DNA的正常復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)細(xì)胞死亡機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前，氟喹諾酮已發(fā)展成為僅次于頭孢菌素的第二大類抗感染化療藥物，對(duì)革蘭氏陽性菌、陰性菌、非典型性細(xì)菌、支原體、衣原體和軍團(tuán)桿菌等具有廣譜抗菌活性，為人類的生命健康做出了巨大貢獻(xiàn)。目前，喹諾酮已發(fā)展到第四代，通常而言新一代喹諾酮比前一代抗菌譜更廣、體內(nèi)活性更高、藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)更優(yōu)和毒副作用更低。

研究表明，氟喹諾酮的活性與其濃度息息相關(guān)，其藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)可能受患者尤其是危重病人、腎功能不全患者和住院患者自身影響。其中，藥時(shí)曲線下面積(AUC)與MIC比值和血藥峰濃度(Cmax)與MIC比值為描述氟喹諾酮活性的最重要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對(duì)二者的優(yōu)化可給予患者有效藥物治療，進(jìn)而降低耐藥性發(fā)生的幾率、提高治愈率。

高效液相色譜(HPLC)與各種檢測器聯(lián)合使用是研究氟喹諾酮藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的常用方法，其中HPLC與紫外(HPLC-UV)、與熒光檢測器(HPLCFLD)和與質(zhì)譜(HPLC-MS)聯(lián)用最為常見。值得一提的是，HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)使微量檢測成為可能。毛細(xì)管電泳法(CE)與UV或FLD聯(lián)合使用是檢測氟喹諾酮的另一重要分析方法。而藥物制劑中的藥物水平可用HPLC或其它檢測手段如紫外光譜、線性掃描伏安法甚至核磁共振(NMR)檢測。樣品在檢測前往往需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，如蛋白沉淀、萃取、溶解、過濾和稀釋等。藥物制劑的預(yù)處理最為簡單僅需要稀釋即可，而生理流體如血液、膽汁、唾液和尿液及組織勻漿的處理則相對(duì)復(fù)雜，這主要是由于內(nèi)源性物質(zhì)可能會(huì)出現(xiàn)在色譜圖或電泳圖上，干擾分析結(jié)果。因此，選擇合理的樣品處理方法和分離條件(合適的溶劑或緩沖液)對(duì)結(jié)果的可靠性而言至關(guān)重要。本文將著重介紹近年來所發(fā)展的第三代和第四代喹諾酮的分析方法及樣品的預(yù)處理方法，為分析人員從事相關(guān)研究提供幫助。

2 第三代氟喹諾酮

左氧氟沙星(LVFX)、巴洛沙星(BLFX)、帕珠沙星(PZFX)和司帕沙星(SPFX)是第三代氟喹諾酮的杰出代表。LVFX不僅可用于治療社區(qū)獲得性肺炎(CAP)、急性上頜竇炎和慢性支氣管炎急性發(fā)作，還可用于消除標(biāo)準(zhǔn)療法無法消除的幽門螺旋桿菌。LVFX的生物利用度完全，故口服和靜脈注射等效。LVFX的代謝較差，在給藥48h后約87%的LVFX經(jīng)尿液清除。LVFX主要的代謝產(chǎn)物為N-氧化物和去甲基LVFX，但二者均沒有活性。BLFX對(duì)革蘭氏陽性菌如耐多藥葡萄球菌和肺炎球菌具有良好的抗菌活性，其在腎中的代謝產(chǎn)物為葡萄糖醛酸和去甲基BLFX衍生物。PZFX對(duì)革蘭氏陰性菌具有優(yōu)秀的活性，對(duì)肝組織、膽囊組織和膽汁具有良好的滲透性，提示本品對(duì)肝病患者而言可能大有作為。SPFX的體外抗分枝桿菌和革蘭氏陽性菌如肺炎鏈球菌和其它鏈球菌及葡萄球菌的活性優(yōu)于環(huán)丙沙星(CPFX)。

2.1 左氧氟沙星

LVFX的定量分析方法眾多（表1），且大多數(shù)基于HPLC，這是由于LVFX在水中具有良好的溶解度。最常用的檢測器有UV和FLD，而含量較低時(shí)可用MS檢測。在LVFX的MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 362.7→261.2、m/z 362.1→318.1和m/z 362.2→261.2的質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。在單MS分析中，經(jīng)常可觀測到m/z 362→318。除MS外，還可采用光電二極管陣列檢測器(PDA)進(jìn)行檢測。流動(dòng)相通常為水或緩沖溶液和有機(jī)溶劑，并加入三乙胺(TEA)以改善峰形、消除拖尾。TEA的含量通常低于＜1%，且流動(dòng)相的pH需顯弱酸性(可用磷酸調(diào)pH)。LVFX含有帶負(fù)電荷的羧基，故離子對(duì)試劑如TEA的加入可顯著地提高分離度。其它極性組分可為磷酸鹽(鈉鹽或鉀鹽)緩沖溶液，濃度在10～30 mmol/L。最常用的有機(jī)相為乙腈(ACN)，等度洗脫時(shí)其濃度通常為14～43%，梯度洗脫時(shí)其濃度隨時(shí)間變化而變化。在親水相互作用液相色譜法(HILIC)中，ACN的濃度可達(dá)80%以上。

在反相HPLC(RP-HPLC)中，主導(dǎo)型的柱子為C18柱，但有時(shí)也使用C8和C4柱。Watabe等評(píng)價(jià)了各種類型的柱子如C18和C8柱在分析LVFX和PZFX時(shí)的效果，發(fā)現(xiàn)C8柱的效果優(yōu)于C18柱，這可能是由于C8柱的空阻低于C18柱所致。LVFX和PZFX均含有7-氧代-吡啶并[1,2,3-de]-1,4-苯并嗪-6-羧酸結(jié)構(gòu)單元，區(qū)別在于LVFX的C-10位為4-甲基哌嗪基，而PZFX的C-10位為1-氨基環(huán)丙基。這些基團(tuán)的存在可能使二者與固定相表面的結(jié)合作用更強(qiáng)，分離效果更高。Fang等采用C4柱對(duì)LVFX、利福平和異煙肼等進(jìn)行了分離，發(fā)現(xiàn)與C18柱相比，C4柱對(duì)這些極性迥異的物質(zhì)分離效果更高。丁基鍵合固定相可縮短非極性物質(zhì)的分析時(shí)間，但對(duì)極性物質(zhì)影響不大，且與長鏈鍵合固定相相比，丁基鍵合固定相的分離度得以保持。親水作用色譜(HILIC)柱也可用于LVFX的分析，其最大的優(yōu)點(diǎn)是能夠有效分離反相作用色譜中難以保留的離子型化合物。HILIC可用常見的反相流動(dòng)相，但有機(jī)溶劑含量較高，故更適用于MS檢測。除ACN外，甲醇也是常見的有機(jī)相，而且可用于等度洗脫和梯度洗脫。硫酸銅(CuSO4)和L-亮氨酸，及甲酸(用于MS檢測)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四丁基醋酸(TBAA)、檸檬酸、醋酸銨、四正丁基溴化銨(TBAmBr)和L-異亮氨酸組成的手性流動(dòng)相添加劑(CMPA)也可作為流動(dòng)相組分使用。Liang等研究結(jié)果表明，流動(dòng)相中的SDS可延長LVFX、加替沙星(GTFX)、莫西沙星(MXFX)和曲伐沙星(TVFX)的保留時(shí)間，而25 mmol/L的磷酸緩沖液和離子對(duì)試劑(TBAA 10 mmol/L)可改善峰型，這可歸因于這種流動(dòng)相有可能能夠阻止固定相上的硅醇基與喹諾酮的氨基發(fā)生二次交互作用。為獲取立體選擇性，可直接向流動(dòng)相中加入手性配體交換試劑，如CuSO4和L-亮氨酸或L-異亮氨酸的加入可立體專一性測定LVFX。二價(jià)銅離子(Cu2+)、L-亮氨酸和水可形成復(fù)合物，該復(fù)合物可與LVFX及其R-對(duì)映異構(gòu)體結(jié)合。這些螯合物具有不同的構(gòu)型，保留時(shí)間不盡相同，可用于檢測藥物劑型中的光學(xué)純度。對(duì)多種氨基酸如L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-絲氨酸和L-丙氨酸等的評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，L-亮氨酸的分離度最高。Devi等報(bào)道了氧化降解的雜質(zhì)分析方法，但非立體專一性，故其應(yīng)用受到了一定的限制。

毛細(xì)管電泳法(CE)也可用于LVFX的檢測，該法不僅用量少，而且適用范圍廣，可用于人尿液、片劑或水中LVFX的檢測。該法既可用于溶液，也可用于非溶液。對(duì)溶液而言，pH在8左右時(shí)最優(yōu)，pH的改變將影響檢測器的相應(yīng)，且pH＜2.5時(shí)溶液可能會(huì)與毛細(xì)管壁發(fā)生相互作用。與柱色譜分離法相比，CE分離法更為復(fù)雜，其分離度受多種因素如pH、電壓、溫度和毛細(xì)管長度等影響，而且樣品中的雜質(zhì)可能會(huì)被毛細(xì)管壁吸收導(dǎo)致分離時(shí)間延長。

紫外-可見光吸收光譜法也被于LVFX的檢測，但該法僅被用于純藥物或藥物制劑的分析。LEVX可直接用于檢測，也可與溴酚藍(lán)(BPB)或溴甲酚綠(BCG)絡(luò)合后在用于檢測。光譜法在檢測市售制劑、人尿和血清時(shí)，需應(yīng)用熒光檢測器，且SDS膠束具有加強(qiáng)熒光的效果。除紫外-可見光吸收光譜法外，NMR、方波陽極溶出伏安法和同步掃描固體基質(zhì)室溫磷光法也可用于LVFX的檢測，但這些方法極少使用，且僅用于制劑的檢測。

表1 LVFX的檢測方法

續(xù)表 表1 LVFX的檢測方法

上述的所有檢測方法均需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，樣品包括血清、血漿、血液、尿液、痰、組織、支氣管肺泡灌洗(BAL)、膽汁、水、滲析液、反應(yīng)液和藥物制劑等。蛋白質(zhì)沉淀用到的主要溶劑有ACN、甲醇、三氟乙酸(TFA)或ACN與甲醇的混合液或高氯酸與甲醇的混合液等。Watabe等發(fā)現(xiàn)采用ACN或乙醇做蛋白質(zhì)沉淀時(shí)會(huì)導(dǎo)致峰很寬或很小；用甲醇時(shí)，上清液不夠清澈；用6%的高氯酸溶液，則回收率低；用6%的高氯酸和甲醇的混合液，則可解決回收率的問題，這可能由于甲醇的加入使得藥物與蛋白質(zhì)共同被萃取至上清液所致。萃取包括液-液萃取(LLE, 萃取溶劑有二氯甲烷、氯仿和正己烷等)、固相萃取(SPE)、柱前提取、分散液-液微萃取和采用索氏提取器萃取等。預(yù)處理還包括微量滲析、超濾、微萃取和稀釋等。Liang等在超濾過程中采用SDS和ACN的混合液作為置換溶液置換與蛋白質(zhì)鍵合的LVFX、MXFX、TVFX和GTFX，以測定藥物總量，發(fā)現(xiàn)該法回收率＞95%。Xu等研究了基于ACN/水體系的LLE在預(yù)處理時(shí)的效果，結(jié)果表明，ACN和0.3%磷酸水溶液(70:30)效果最優(yōu)。之所以用ACN和水溶液是為避免使用純ACN時(shí)的樣品固化問題，但ACN含量過低會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)析出不完全。而70:30這一比例即可獲得最優(yōu)的回收率，又可去除蛋白質(zhì)。然而，萃取和沉淀技術(shù)在血漿、血清、BAL、尿液和組織勻漿的預(yù)處理過程中并不常見。稀釋是預(yù)處理藥物制劑的常規(guī)方法。采用分離技術(shù)對(duì)LVFX進(jìn)行分析時(shí)往往需要添加內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)的加入無疑為結(jié)果的可重復(fù)性和準(zhǔn)確性提供了保障。

檢測限(LOD)和定量限(LOQ)與所測樣品及檢測器息息相關(guān)，對(duì)熒光檢測器而言，藥物制劑的LOD和LOQ可低至10-9g/mL。檢測器對(duì)血漿、尿液和血清的檢測限更高，且MS的靈敏度高于UV和FLD。但在常規(guī)臨床實(shí)踐中，峰濃度和谷濃度往往mg/L級(jí)別上，故不需要檢測極低的濃度。

2.2 巴洛沙星

為檢測BLFX，HPLC常與MS和UV檢測器聯(lián)用（表2）。分離常用C18柱，有機(jī)相為ACN和甲醇，往往向水相中加入醋酸銨和磷酸二氫鉀。流動(dòng)相為弱酸性，當(dāng)用磷酸二氫鉀調(diào)pH至6.5時(shí)，樣品的分離度和拖尾得以明顯改善。Bian等評(píng)價(jià)了10 mmol/L醋酸銨在不同pH值(6.65 vs 3.0)時(shí)的效果，發(fā)現(xiàn)低pH值有利于改善樣品的分離度和拖尾情況。

對(duì)血漿而言，預(yù)處理可用LLE，而藥物制劑則可采用稀釋。在LLE中，二氯甲烷和乙酸乙酯的混合液與正己烷和異丙醇的混合液相比效果更優(yōu)。在萃取過程中，不推薦使用酸(鹽酸/HCl, 1mol/L)或堿(氫氧化鈉/NaOH, 1mol/L)，這是由于酸和堿的存在會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)干擾。MS的LOD和LOQ極低，且常選取準(zhǔn)分子離子峰m/z 390 ([M+H]+)進(jìn)行檢測。

2.3 帕珠沙星

PZFX的檢測方法有HPLC和CE技術(shù)，且二者可用于藥物制劑(片劑)、牛奶和生物體液如血清、血漿、尿、肌肉勻漿、唾液和齦溝液等（表3）。HPLC常用C18和C8柱，且流動(dòng)相中的ACN含量一般不超過15.5%，其它組分為0.5%磷酸和1% TFA或0.1%甲酸，并用TEA調(diào)pH至3.0。CE通常在室溫下進(jìn)行，背景電解質(zhì)(BGE)為三羥甲基氨基甲烷(TRIS)和磷酸水溶液。β-環(huán)糊精和磷酸鹽也可作為添加物，且pH需在5.04～9.00。所用電壓取決于毛細(xì)管長度，毛細(xì)管越短電壓越低。

樣品預(yù)處理包括蛋白質(zhì)沉淀(甲醇、ACN或6%的高氯酸甲醇溶液)、LLE(二氯甲烷)和稀釋等。LOD取決于預(yù)處理，萃取為0.01～0.3 μg/mL，蛋白質(zhì)沉淀為0.01～0.1 μg/mL，稀釋尿液為7 μg/mL。

2.4 司帕沙星

SPFX的檢測方法主要有光譜技術(shù)和色譜技術(shù)（表4），分離主要靠HPLC、超高效液相色譜(UPLC)和CE。研究發(fā)現(xiàn)，與UPLC相比，單引物擴(kuò)增反應(yīng)(SPAR)可降低拖尾效應(yīng)和縮短保留時(shí)間(10倍)。UPLC的理論塔板數(shù)是HPLC的3倍，分離效果更優(yōu)。色譜法的檢測器有UV、DAD和MS。在MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 393.2→349.3和m/z 392.9→348.7的MRM模式。分離主要用C18柱，且可應(yīng)用于血漿、血清、尿液和組織(肌肉)。流動(dòng)相的有機(jī)相主要為ACN，其在等度洗脫時(shí)含量可達(dá)80%，但在其它條件下，其含量僅在12～20%。除ACN外，甲醇也較為常見。流動(dòng)相中的添加物主要有0.1%磷酸、5%醋酸、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、54 mmol/L甲酸、10 mmol/L醋酸銨和0.1%TFA等。CE在四硼酸緩沖液中進(jìn)行，并向其中加入硅納米粒，且pH在9.0左右。

樣品預(yù)處理包括蛋白質(zhì)沉淀(20%高氯酸和ACN)、LLE(乙酸乙酯)、用ACN/水外加磷酸和正己烷萃取及稀釋。向流動(dòng)相中加入少量的磷酸可提高肌肉組織的SPFX回收率，但加入甲酸時(shí)回收率較低。LOD取決于檢測器，且MS最優(yōu)。

3 第四代氟喹諾酮

常見的第四代氟喹諾酮有MXFX、TVFX、西他沙星(STFX)、普盧利沙星(PLFX)、吉米沙星(GMFX)和加替沙星(GTFX)等。其中，MXFX抗菌譜極廣，包括革蘭氏陽性菌和陰性菌如葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌及非典型性細(xì)菌和厭氧菌等。MXFX可用于治療結(jié)膜炎、角膜炎、術(shù)前和術(shù)后控制眼部感染、CAP和耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)的治療。包含MXFX的療法，可縮短治療結(jié)核病(TB)的療程。TVFX的抗菌譜包括革蘭氏陽性菌和陰性菌，但本品由于會(huì)導(dǎo)致特異性肝毒性于1999年撤出市場，目前僅作獸藥使用。STFX的抗菌譜包括革蘭氏陽性菌和陰性菌、衣原體屬和支原體屬，對(duì)耐喹諾酮金葡球菌、肺炎球菌屬和假單胞菌屬同樣有效。PLFX是尤利沙星(ULFX)的前藥，其在體內(nèi)可迅速的轉(zhuǎn)化為后者。PLFX主要用于治療單純性膀胱炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作及兒童和成人下尿路感染。GMFX也是廣譜抗菌喹諾酮，其對(duì)革蘭氏陽性菌的活性顯著增強(qiáng)。本品對(duì)肺炎鏈球菌的活性是MXFX的4倍，且對(duì)流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌和非典型性嗜肺性軍團(tuán)病桿菌、衣原體屬和支原體屬同樣有效。GTFX同樣對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌具有良好的活性，其對(duì)耐甲氧西林肺炎鏈球菌也具有良好的活性。

表2 BLFX的檢測方法

表3 PZFX的檢測方法

表4 SPFX的檢測方法

3.1 莫西沙星

MXFX的分析方法眾多，但主要是HPLC和各種檢測器如UV、FLD、MS和DAD聯(lián)用（表5）。UVVis可用于檢測藥物制劑或純物質(zhì)，而除此之外，CE也有文獻(xiàn)報(bào)道。

HPLC的流動(dòng)相主要為磷酸緩沖液，且濃度在10～50 mmol/L，但也有使用高濃度磷酸鈉緩沖液(0.25 mol/L)的報(bào)道。其它添加物大多數(shù)為羧酸如檸檬酸、甲酸、醋酸、TFA或三氟乙酸酐，而鹽主要為醋酸銨和SDS。Chan等發(fā)現(xiàn)TFA對(duì)熒光信號(hào)無干擾。離子對(duì)試劑也可用作添加劑，如0.03～2.00%TEA等。MS檢測器所需濃度最低，而對(duì)其它檢測器而言，TEA的最低濃度通常為0.1%。其它離子對(duì)試劑還有TBAA、TBAmBr和四丁基氯化銨(TBA·Cl)等，由于離子對(duì)試劑會(huì)和硅醇發(fā)生相互作用，會(huì)改善拖尾情況。離子對(duì)試劑總體而言會(huì)降低固定相的硅醇利用度，故用量盡可能少。添加離子對(duì)試劑過多時(shí)會(huì)導(dǎo)致柱平衡時(shí)間的延長和難以從柱子上沖洗干凈，導(dǎo)致柱體污染。當(dāng)pH在4.5和5.5時(shí)，拖尾嚴(yán)重，這可能是由于固定相硅醇的負(fù)電荷和MXFX胺基的正電荷共同作用的結(jié)果。但將pH降低至3.5時(shí)拖尾現(xiàn)象有所改善，這是由于硅醇在pH高于3.5時(shí)會(huì)發(fā)生離子化進(jìn)而與伯胺和仲胺結(jié)合。水的含量在等度洗脫時(shí)通常為57～95%，而有機(jī)相可為ACN、甲醇或二者混合物，且pH為2.5～6。Laban-Djurdevi?等優(yōu)化了響應(yīng)面分析法，發(fā)現(xiàn)ACN的含量及pH是影響保留時(shí)間和分辨率的最重要因素，其次是磷酸緩沖液的離子強(qiáng)度。研究顯示，響應(yīng)面平面最大位置在ACN的含量為10～15%，pH為3.0～4.5。

在MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 402.1→260.0、m/z 402.0→358.2、m/z 402→384和m/z 402→358的MRM模式。

CE也可用于MXFX的分離，且BGE由緩沖液(有機(jī)相和無機(jī)相)、鹽和TEA組成。檢測在室溫下進(jìn)行，且γ-環(huán)糊精硫酸的加入可提高M(jìn)XFX和其對(duì)映異構(gòu)體的分離度。pH取決于流動(dòng)相的組成，且酸和堿均可。

Ashour等報(bào)道了一種在四價(jià)鈰離子(Ce4+)存在的條件下將MXFX與3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙鹽酸鹽單水合物(MBTH)絡(luò)合以測定藥物制劑和純物質(zhì)中MXFX的簡單方法，該法適用于動(dòng)力學(xué)分析。Djurdevic和Cruz等分別采用基于HPLC和CE的方法進(jìn)行雜質(zhì)分析，HPLC適用于雜質(zhì)和強(qiáng)制降解產(chǎn)物分析，而CE適用于檢測MXFX的S,S-、R,R-、R,S-和S,R-光學(xué)異構(gòu)體。其中，S,S-是MXFX的活性構(gòu)型，其它3個(gè)則為潛在的MXFX強(qiáng)制降解產(chǎn)物。

樣品預(yù)處理方法有萃取(經(jīng)典的LLE, 用二氯甲烷、乙酸乙酯; SPE; 在線柱前萃取和氰基丙咪嗪萃取)、蛋白質(zhì)沉淀(ACN、甲醇、二者的混合液和高氯酸)、稀釋和過濾等。

可分析的樣品有血漿、血清、血液、唾液、玻璃體和房水、藥物制劑(滴眼液和片劑)及純物質(zhì)等。在生物樣品中，用到的主要預(yù)處理方法為萃取和蛋白質(zhì)沉淀。但以SDS為替換試劑的超濾或微過濾技術(shù)可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的溶解性和降低蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合，故二者也偶有使用。對(duì)SDS濃度優(yōu)化結(jié)果表明，SDS最優(yōu)濃度為10 mmol/L且需磷酸緩沖液調(diào)pH至3.0。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SDS的加入可提高熒光強(qiáng)度，有利于分離。藥物制劑的預(yù)處理主要是稀釋，且在絕大多數(shù)情況下需加內(nèi)標(biāo)。

LOD和LOQ大多數(shù)集中在μg/mL級(jí)別，但MS和FLD或UV檢測器可檢測到ng/mL水平。

表5 MXFX的檢測方法

3.2 曲伐沙星

TVFX可用HPLC與UV或FLD聯(lián)用進(jìn)行分析（表6），分離用C18柱，有機(jī)相為ACN或與甲醇的混合物。離子對(duì)試劑可用四丁基氫氧化銨、四丁基銨的硫酸氫鹽、醋酸鹽或TFA鹽，無機(jī)試劑可用磷酸二氫鈉、磷酸鈉或0.1%甲酸。其它添加物可用檸檬酸或SDS，流動(dòng)相需弱酸性。可分析的樣品主要有尿和血漿。對(duì)血漿和痰樣品而言，可用ACN、ACN與高氯酸混合液和20%高氯酸預(yù)處理樣品，也可用0.5%SDS超濾樣品，而尿樣需要稀釋。蛋白質(zhì)沉淀法的LOD與上述色譜分離相似，而尿樣的LOD較高。TVFX也可用微分脈沖吸附溶出伏安法進(jìn)行分析，此時(shí)，預(yù)處理為過濾，且LOD高于其它方法。

3.3 西他沙星

STFX可用色譜法與MS聯(lián)用進(jìn)行分析（表7）。在MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 410.1→392.1和m/z 410.1→392.2的MRM模式。所報(bào)道的流動(dòng)相相似，即甲醇和0.1%的甲酸混合液。當(dāng)提高甲酸的濃度時(shí)，需提高柱溫。預(yù)處理用蛋白質(zhì)沉淀法，試劑為甲醇和0.1%甲酸或異丙醇。

3.4 普盧利沙星

PLFX是ULFX的前藥，二者往往同時(shí)檢測，且ULFX通常被認(rèn)為是PLFX的雜質(zhì)（表8）。PLFX和ULFX均可以HPLC與UV或MS檢測器聯(lián)合或CE法直接檢測。在MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 462→444、m/z 462→418、m/z 460→360和m/z 462→350的MRM模式分析PLFX，采用m/z 350→248的MRM模式分析ULFX。目前，用于檢測的有片劑、降解產(chǎn)物、房水、血漿和尿液，所用柱子有C18、C8和親水作用色譜(HILIC)柱。流動(dòng)相中有機(jī)相主要為ACN和甲醇，ACN可被醇替代，但用HILIC柱要達(dá)到同樣的保留時(shí)間需提高有機(jī)相的含量。當(dāng)用MS檢測時(shí)，流動(dòng)相還可加入磷酸二氫鉀、醋酸銨、磷酸和甲酸等添加物。而CE法中的BGE則由檸檬酸鈉、檸檬酸和硫酸鈉。

對(duì)于片劑而言，預(yù)處理主要是粉碎和用適宜的溶劑溶解，液體樣品則可稀釋，蛋白質(zhì)沉淀則可用甲醇。LOD取決于檢測樣品和檢測器，其中MS對(duì)PLFX而言LOD最低。同樣的檢測手段，ULFX的LOD要高于PLFX。

3.5 吉米沙星

GMFX可用HPLC和高效薄層色譜(HPTLC)分析，其中HPLC可與FLD、UV和PDA檢測器聯(lián)用，而HPTLC則與UV檢測器聯(lián)用。常用的柱子有C18和HILIC柱，有機(jī)流動(dòng)相有ACN和甲醇，水相為10 mmol/L的醋酸銨或0.1%TFA或醋酸鈉或磷酸水溶液。HPTLC則用乙酸乙酯和氨水做展開劑。樣品可以是血液、血漿和反應(yīng)液。預(yù)處理的方法包括萃取、超濾、LLE和稀釋。FLD的LOD要低于UV和PDA檢測。

3.6 加替沙星

GTFX可用HPLC和CE分離，其中HPLC可與FLD、UV和MS檢測器聯(lián)用，而CE則與UV、電容耦合非接觸性電導(dǎo)檢測和電致發(fā)光檢測器聯(lián)用（表9）。

表6 TVFX的檢測方法

表7 STFX的檢測方法

柱色譜主要用C18柱，有機(jī)流動(dòng)相有ACN和甲醇，離子對(duì)試劑有TBAA、TEA、TBAmBr和TBA·Cl。其它添加劑有磷酸鹽、SDS、檸檬酸、0.1%甲酸、TFA、醋酸銨和磷酸。流動(dòng)相微酸性，可等度洗脫也可梯度洗脫。除少數(shù)HPLC在35和28℃進(jìn)行外，其它HPLC均可在室溫條件下進(jìn)行。CE法可在PBS、TRIS/鹽酸、四硼酸緩沖溶液、環(huán)糊精的磷酸酯緩沖溶液、四硼酸二鈉鹽與硅納米粒、酒石酸和醋酸鈉體系進(jìn)行。在MS/MS分析中，經(jīng)常采用m/z 375.9→332.0和m/z 375.9→260.9的MRM模式進(jìn)行分析。

可用于分析的樣品有片劑、藥物制劑、血清、血漿、血液、尿樣、肌肉、房水和玻璃體及食物樣品。預(yù)處理方法包括碾碎和溶解、超濾、在線柱萃取、蛋白質(zhì)沉淀(ACN、甲醇或二者混合物)、用合適溶劑溶解、LLE、SPE和加速溶劑萃取(ASE)。Fu等發(fā)現(xiàn)SPE在分析過程中不會(huì)產(chǎn)生不可接受的干擾，而Tasso等則研究了在線SPE和HPLC聯(lián)用技術(shù)。LOD和LOQ均取決于所用檢測器，且MS較低。

4 結(jié)束語

氟喹諾酮含有兩個(gè)可與質(zhì)子結(jié)合的基團(tuán)即氨基和羧基，其兩性離子的特性使得氟喹諾酮很容易離子化，這就導(dǎo)致對(duì)此類物質(zhì)的分析顯得較為復(fù)雜。其中，峰拖尾和分離度差是分析過程中遇到的主要問題。ACN和甲醇是梯度洗脫和等度洗脫最常用的有機(jī)溶劑，且ACN的洗脫能力高于甲醇，使得色譜圖上的峰信息較全。向ACN中加入甲醇，對(duì)分離度有影響。分離氟喹諾酮時(shí)經(jīng)常用反相，且常用的柱子有C18、C8和C4柱。HILIC柱也偶有使用，其是RP-HPLC分離親水離子樣品的良好替代品。HILIC需要至少80%的有機(jī)相(主要是ACN)，且適合與MS聯(lián)用。在氟喹諾酮的分析中，一個(gè)重要的組分是離子對(duì)試劑(TEA, TBAA, SAS或其它)。當(dāng)加入離子對(duì)試劑時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致柱平衡時(shí)間延長和試劑殘留，但離子對(duì)試劑可加強(qiáng)藥物與固定相的相互作用。因此，是否需要加入離子對(duì)試劑，檢測人員需綜合考慮。所用色譜柱和其它添加劑如有機(jī)或無機(jī)鹽、離子對(duì)試劑，及pH均可能影響峰型和LOD及LOQ。其它需要考慮的是樣品的預(yù)處理和所用檢測器，生物流體的LOD或LOQ要高于藥物制劑或溶液。蛋白質(zhì)沉淀的LOD和LOQ要高于萃取(LLE或SPE)。盡管萃取相對(duì)費(fèi)力，但在檢測低含量樣品時(shí)不可或缺。對(duì)藥物制劑而言，預(yù)處理稀釋就足夠了，且可用UV、可見光和熒光光譜檢測。對(duì)于需要去蛋白質(zhì)的樣品，蛋白質(zhì)沉淀法是最簡單的途徑，且回收率高于萃取(LLE和SPE)。LLE或SPE相對(duì)較為復(fù)雜，需要蒸除溶劑和溶解樣品，這不僅費(fèi)時(shí)，而且需要額外的試劑和儀器。組織勻漿的預(yù)處理更為復(fù)雜，需要去除蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。蛋白質(zhì)沉淀需要在溶劑中完成，且需要加水溶液，以避免蛋白質(zhì)固化包裹樣品，導(dǎo)致回收率降低。當(dāng)樣品中含有不止一個(gè)能被檢測出的組分時(shí)，需運(yùn)用分離技術(shù)。當(dāng)LOD和LOQ較低時(shí)，需采用熒光檢測器或MS檢測器。MS檢測器與萃取聯(lián)用時(shí)，LOD可低至pg/mL。MS分析需要有機(jī)酸作為質(zhì)子化溶劑，如甲酸、乙酸或與甲酸銨、醋酸銨的混合物。串聯(lián)MS/MS是MS檢測中使用最多檢測手段。

表8 PLFX和ULFX的檢測方法

表9 GMFX和GTFX的檢測方法

在臨床分析中，需要快速的獲得分析結(jié)果以確定治療方案，蛋白質(zhì)沉淀和HPLC聯(lián)用是理想的搭配。若沒有MS檢測條件，采用內(nèi)標(biāo)法的FLD或UV檢測也不失為一種快速、廉價(jià)的替代方案。第三代和第四代氟喹諾酮在血液和其它流體的濃度在mg/L水平，HPLC與FLD或UV聯(lián)用恰在此范圍內(nèi)。而用內(nèi)標(biāo)法可補(bǔ)償萃取過程中的損失，可重復(fù)性較高。

總之，本文介紹近年來所發(fā)展的第三代和第四代喹諾酮的分析方法及樣品的預(yù)處理方法，為分析人員今后從事相關(guān)研究提供參考。