都田趙,王雪蓮

(中國醫(yī)科大學(xué) 病原生物學(xué)教研室,遼寧 沈陽 110122)

宮頸癌是嚴重威脅婦女健康的主要疾病之一。我國是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，每年新發(fā)病例及死亡病例占世界病例總數(shù)的四分之一以上[1]。近年宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化的趨勢[2-3]，年輕宮頸癌患者(≤35歲)在全部宮頸癌病例中所占比例由原來的3.42%升至近年的24.91%[2]。已有證據(jù)表明宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸受DNA甲基化、微小核糖核酸表達異常[4-6]等分子遺傳學(xué)機制調(diào)控。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)通過多種機制調(diào)控基因的表達，進而在包括惡性腫瘤在內(nèi)的疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7-8]。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)circRALB在宮頸癌組織中高表達。通過檢索circBase數(shù)據(jù)庫可知，circRALB是來源于2號染色體RALB基因編碼區(qū)的環(huán)狀RNA。目前對于circRALB的研究尚未見報道，其發(fā)揮的生物學(xué)功能也不明確。本研究探討circRALB對宮頸癌細胞株Hela細胞生物學(xué)行為的影響，明確circRALB在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，進而為宮頸癌的靶向性治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 宮頸癌細胞株Hela細胞源自中國醫(yī)科大學(xué)病原微生物學(xué)教研室，jetPRIME轉(zhuǎn)染試劑購自達科為生物技術(shù)公司，TRIzol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量PCR試劑購自Promega公司，Annexin V-FITC/PI Kit凋亡檢測試劑購自四正柏生物公司，circRALB干擾序列(si_RALB：ACAAGCUCUUCAGUGGGUCAU)、無關(guān)序列(si_nc：GCACG/ideoxyu/CCGUAUACGUA-AAGCUU)、熒光無關(guān)序列(si_nc_FAM：GCACG/ideoxyu/CCGUAUACGUAAAGCUU-FAM)、RALB上游引物(AGCCCTGACGCTTCAGTTC)、RALB下游引物(AGCGGTGTCCAGAATATCTATCT)、內(nèi)參18S上游引物(GAAACGGCTACCACATCC)、18S下游引物(ACCAGACTTGCCCTCCA)均由生工生物工程有限公司合成。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱(Thermo-371，美國賽默飛)；超凈工作臺(DL-CJ-2N，北京哈東聯(lián))；冷凍離心機(Allergra X-15R，美國貝克曼)；倒置顯微鏡(CKX31，日本奧林巴斯)；倒置熒光相差顯微鏡(Leica DMi8，德國萊卡)；熒光定量PCR儀(LightCycler?480，瑞士羅氏)；流式細胞儀(AccuriC6，美國BD 生物科學(xué))；光吸收酶標儀(TECAN Sunrise，瑞士帝肯)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hela細胞采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)(內(nèi)含青霉素100 u/mL，鏈霉素0.01 mg/mL)。培養(yǎng)箱條件為溫度37 ℃，CO2濃度5%。待細胞狀態(tài)良好時進行實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 細胞接種于12孔板，接種量為每孔1×105個。待細胞生長至60%融合度時進行轉(zhuǎn)染。將干擾序列(si_nc_FAM/si_nc/si_RALB)分別加入含有100 μL jetPRIME Buffer的離心管中，干擾序列轉(zhuǎn)染量為每孔板50 nmol/L。隨后向離心管中加入3 μL jetPRIME reagent，斡旋10 s。常溫孵育15 min后，將其逐滴加入到含5%血清的Hela細胞中。

1.2.3 計算轉(zhuǎn)染效率 使用倒置熒光顯微鏡，分別在明場下和熒光場下觀察同一視野轉(zhuǎn)染si_nc_FAM的Hela細胞，轉(zhuǎn)染效率=熒光場發(fā)熒光細胞數(shù)/明場總細胞數(shù)。觀察3個視野，計算均值。

1.2.4 熒光定量 PCR檢測circRALB表達 TRIzol法提取總RNA，驗證濃度及純度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄PCR條件為退火25 ℃，5 min；延伸42 ℃，60 min；70 ℃，15 min；4 ℃保存。用circRALB的特異引物及SYBR Green I 熒光染料進行定量PCR檢測，所用內(nèi)參為18S。熒光定量PCR 反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，共45個循環(huán)。相對定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法。2-ΔΔCt=2-(ΔCt si_RALB-ΔCt si_nc)，ΔCt si_RALB=si_RALB組Ct值的均值-對應(yīng)內(nèi)參18S的Ct值的均值，ΔCt si_nc=正常組織si_nc組Ct值的均值-對應(yīng)內(nèi)參18S的Ct值的均值，并將si_nc組的相對表達量定為1。

1.2.5 細胞計數(shù) 轉(zhuǎn)染24 h后，用細胞計數(shù)板計數(shù)，顯微鏡下計數(shù)左上、左下、右上、右下4個中方格中細胞數(shù)，取均值計算細胞濃度。

1.2.6 MTS法檢測細胞增殖活性 瞬時轉(zhuǎn)染后，將5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)3個復(fù)孔；每孔加完全培養(yǎng)基(1640+10%胎牛血清)100 μL；37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTS試劑20 μL，培養(yǎng)箱孵育。在490 nm波長下，用酶標儀檢測培養(yǎng)細胞的光密度(OD)。

1.2.7 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 轉(zhuǎn)染48 h后，收集 2×105個細胞，每 100 μL細胞懸液加入 5 μL AnnexinV-FITC試劑混勻，避光孵育5 min。再加入5 μL PI試劑。隨后加入400 μL PBS。在1 h內(nèi)進行檢測，觀察細胞凋亡情況。

1.2.8 細胞劃痕實驗檢測細胞的遷移功能 轉(zhuǎn)染后24 h，收集細胞，接種細胞至6孔板中,細胞濃度為5×105個/孔。次日用200 μL槍頭在6孔板底部劃直線，PBS洗滌后加入無血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。在0、24 h時間點拍照，比較細胞的遷移功能。

1.2.9 Transwell小室檢測細胞的侵襲功能 向Transwell小室中加入100 μL無血清1640培養(yǎng)基細胞懸液，細胞數(shù)為1×105個。底部小室加入含 10% 胎牛血清的 1640 培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛1 mL室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min。擦去小室底部內(nèi)表面的細胞，正置于載玻片上，在100倍光鏡下隨機取3個視野，計數(shù)穿膜的細胞數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干擾序列在Hela細胞中的轉(zhuǎn)染效率

為評價circRALB的干擾序列轉(zhuǎn)入到Hela細胞中的效率，轉(zhuǎn)染帶有熒光標記FAM的無關(guān)序列到Hela中(圖1)。12 h后，用熒光顯微鏡觀察同一視野下的明場和熒光場細胞，計算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率為(89.67±3.1)%。

圖1 熒光顯微鏡觀察無關(guān)序列的轉(zhuǎn)染效率Fig.1 The transfection efficiency of extraneous sequences under one fieldA：明場；B：熒光場A：Bright field；B：Fluorescence field

2.2 si_RALB顯著抑制Hela細胞中circRALB的表達

轉(zhuǎn)染si_RALB后24 h，檢測樣本中circRALB的表達情況見圖2。si_RALB轉(zhuǎn)染組的circRALB表達量為si_nc組的(47.3±1.5)%，且結(jié)果有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(t=7.813，P<0.05)。

圖2 si_RALB干擾circRALB的表達情況Fig.2 si_RALB interferes the expression of circRALB*P<0.05，表示統(tǒng)計學(xué)差異，下圖同

2.3 si_RALB對Hela細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染后計數(shù)細胞，實驗組細胞數(shù)(9.5±1.13)×104顯著少于對照組(14.17±0.68)×104，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.542，P<0.05，n=3)。MTS法檢測si_RALB對Hela細胞增殖的影響。在第4小時，si_RALB組細胞的OD490值(1.132±0.031)與si_nc組(1.442±0.031)相比顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.195，P<0.05，n=3)，表明si_RALB對Hela細胞的增殖能力有顯著影響(圖3)。

圖3 si_RALB對Hela細胞增殖影響的結(jié)果Fig.3 Effects of si_RALB on Hela proliferationA：轉(zhuǎn)染24 h后，細胞計數(shù)結(jié)果；B：轉(zhuǎn)染24 h后，MTS檢測結(jié)果A：the cell count after transfection 24 hours；B：the MTS test result after transfection 24 hours

2.4 si_RALB對Hela細胞的凋亡的影響

流式細胞術(shù)雙染法檢測各組細胞的凋亡情況，結(jié)果顯示si_RALB組細胞凋亡率(9.17±1.17)%，si_nc組細胞凋亡率(7.2±0.32)%，control組細胞凋亡率(5.63±0.31)%，si_RALB組細胞凋亡率大于si_nc組細胞凋亡率，但無顯著統(tǒng)計學(xué)差異(t=1.386，P>0.05，n=3)，表明si_RALB對Hela細胞的凋亡無顯著影響(圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)染后48 h三組細胞的凋亡示意圖Fig.4 Apoptosis of three groups after transfection 48 hoursA：空白對照組；B：si_nc轉(zhuǎn)染組；C：si_RALB轉(zhuǎn)染組；D：凋亡細胞統(tǒng)計圖A：control group；B：si_nc transfection group；C：si_RALB transfection group；D：Statistical histogram of apoptotic cells

2.5 si_RALB對Hela細胞的遷移能力的影響

轉(zhuǎn)染24 h后進行劃痕實驗，通過觀察劃痕愈合能力檢測各組細胞的遷移能力。通過觀察0 h和24 h的劃痕結(jié)果發(fā)現(xiàn)，si_RALB轉(zhuǎn)染組與si_nc組相比，劃痕間距縮小不明顯(圖5)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)染si_RALB后，Hela細胞的遷移能力下降。

圖5 0 h和24 h三組細胞的劃痕間距示意圖Fig.5 The display of scratch test results of three groups at 0 h and 24 h

2.6 si_RALB對Hela細胞侵襲能力的影響

Transwell小室檢測各組細胞的侵襲能力，方差分析進行組間比較。si_RALB轉(zhuǎn)染組Hela細胞穿膜數(shù)為(21.33±2.19)個，顯著低于si_nc組(45.33±1.76)個和control組(52±1.53)個(F=76.35，P<0.05，n=3)。實驗結(jié)果表明si_RALB能顯著降低Hela細胞的侵襲能力(圖6)。

圖6 si_RALB對Hela細胞侵襲能力的影響Fig.6 Influence of si_RALB on the invasiveness of Hela cellsA：三組細胞的穿膜情況鏡下示意圖；B：三組細胞的穿模數(shù)統(tǒng)計圖A：The invasion of three groups under the Microscope；B：Statistical histogram of invasion results

3 討 論

持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。人乳頭瘤病毒預(yù)防疫苗的成功研發(fā)對宮頸癌的預(yù)防做出了重大貢獻，但腫瘤治療仍要面對腫瘤細胞異質(zhì)性和機體復(fù)雜免疫微環(huán)境等新的挑戰(zhàn)[9-10]。在一些發(fā)展中國家，通過疫苗接種預(yù)防宮頸癌在短期內(nèi)仍然難以實現(xiàn)。因此，尋找新的宮頸癌分子生物標志物及治療靶點仍是一個熱點問題。

Salzman等[11]提出circRNA廣泛存在于包括人類在內(nèi)的真核細胞中，隨后，Jeck等[12]在人類的成纖維細胞中檢測出高達25 000多種circRNA。隨著研究的進一步深入，人們開始意識到circRNA在人體普遍存在[13]，circRNA可以與微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合，遵循互補堿基配對的原則，通過競爭性地與miRNA反應(yīng)元件(MREs)結(jié)合，發(fā)揮miRNA海綿作用，功能性釋放mRNA，逆轉(zhuǎn)miRNA下游基因的抑制作用，從而增加了目標基因的表達[14-15]。因此，circRNA可能在人類疾病譜中有重要作用。研究 circRNA及其作用機制，對尋找疾病診斷的治療靶點和進行疾病相關(guān)治療均有重要意義。

我們前期用circRNA微陣列芯片分析檢測了宮頸癌組織的circRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)circRALB在宮頸癌組織中高表達，于是采用瞬時轉(zhuǎn)染其干擾序列的方法，來研究circRALB在Hela細胞中的生物學(xué)功能。瞬時轉(zhuǎn)染方法簡單、快捷，避免復(fù)雜表達載體的構(gòu)建和可能形成的干擾，有效抑制特定circRNA的表達。本研究的瞬時轉(zhuǎn)染效率為(89.67±3.1)%，保證了干擾序列進入細胞后的干擾效率。

細胞的增殖和凋亡異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中占有重要地位。我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)circRALB的表達對Hela細胞的增殖有明顯影響，提示circRALB可能會與腫瘤形成過程中瘤體大小有關(guān)。si_RALB轉(zhuǎn)染后，細胞凋亡情況變化并不顯著。可能導(dǎo)致此結(jié)果的原因有以下幾方面。首先，雖瞬時轉(zhuǎn)染效率在轉(zhuǎn)染后12 h高達(89.67±3.1)%，但凋亡檢測時間為轉(zhuǎn)染后48 h，且si_RALB對circRALB的干擾效率為53%，可能是其不足以產(chǎn)生凋亡的變化的原因；其次，si_RALB的干擾作用是基于與circRALB的堿基互補配對機制來產(chǎn)生，其有效性可能是有限的；第三，circRALB可能在促進細胞的凋亡方面不起作用。

轉(zhuǎn)移和侵襲是宮頸癌的惡性生物學(xué)行為。通過轉(zhuǎn)染si_RALB后，Hela細胞的遷移和侵襲能力顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)可能揭示宮頸癌患者病情晚期出現(xiàn)局部浸潤和轉(zhuǎn)移的重要機制。宮頸癌治愈困難，侵襲生長和遠處轉(zhuǎn)移是不可缺少的原因，由于si_RALB能抑制宮頸癌細胞系Hela細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，因此，利用反義寡核苷酸技術(shù)抑制或降低circRALB的表達水平[16]，對于今后宮頸癌的靶向性治療具有啟發(fā)作用。因此，circRALB在宮頸癌腫瘤組織中的差異性表達使其可能成為腫瘤診斷的標志物，甚至是潛在的藥物治療靶點，這為未來宮頸癌circRNA的研究提供方向與參考。