萬亞會 吳偉 張軒 孫曉倩 薛蓉

α7-nAChR是煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholinereceptor，nAChR）的一種亞型，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與介導學習、記憶鞏固、運動、注意力等過程[1]，研究表明α7-nAChR對鈣離子有較高的滲透性[2]，增強谷氨酸鹽的釋放，具有神經(jīng)保護、促進突觸再生及神經(jīng)元生存的作用[3]，可能在認知功能障礙的發(fā)展中起重要作用。目前的研究多關注α7-nAChR在卒中[4]、心肌缺血再灌注[5]、肺損傷[6]等動物模型中的表達及作用機制。睡眠是人類重要的生理過程，快速眼球運動（rapid eyes movement，REM）睡眠期對記憶形成、鞏固及突觸的可塑性具有重要作用[7]，睡眠不足會引起日間嗜睡、注意力不集中及學習工作效率的下降，長期睡眠不足或睡眠剝奪可導致認知功能下降[8]。因此本研究旨在觀察慢性睡眠剝奪對小鼠海馬組織α7-nAChR的影響，為今后深入探索α7-nAChR在睡眠剝奪后認知功能下降的可能機制提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 實驗對象與分組雄性C57BL/6J小鼠，7～8周齡，體重在20 g～23 g之間，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。C57BL/6J小鼠隨機分為3組，每組24只，對照（CC）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng)1周，對照組再同籠飼養(yǎng)7 d后處死；慢性睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng) 1 周，利用改良多平臺水環(huán)境法進行慢性睡眠剝奪7 d后處死；慢性睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動劑-PHA-543613（SD+PHA-543613）組：適宜環(huán)境下飼養(yǎng)1周，利用改良多平臺水環(huán)境法進行睡眠剝奪7 d，睡眠剝奪結束后6 h腹腔注射α7-nAChR受體激動劑PHA-543613（6 mg/kg，sigma公司，美國），連續(xù)腹腔注射3 d后處死，CC組于處死前3 d連續(xù)腹腔注射等量的生理鹽水，所有小鼠均嚴格遵循12 h光照，12 h黑暗的晝夜節(jié)律。

1.2 實驗方法

1.2.1 慢性睡眠剝奪模型的建立 使用改良多平臺水環(huán)境法（modified multiple platform method，MMPM）對小鼠進行慢性睡眠剝奪，剝奪箱內(nèi)均勻放有8個圓形平臺，造模前向剝奪箱內(nèi)加水至平臺下方約 1 cm處，水溫保持在（22±2）℃，剝奪箱頂部放置水和食物，小鼠可在平臺間自由活動、攝食及飲水，每天定時更換水以保持清潔。睡眠剝奪過程保證 12 h 光照（9：00～21：00）、12 h 黑暗（21：00～9:00）的晝夜節(jié)律。造模開始前3 d每天定時把SD組的小鼠放在睡眠剝奪水箱內(nèi)適應環(huán)境，每天適應2 h。睡眠剝奪過程從9：00開始，每天17:00～21:00把小鼠從剝奪箱中拿出，放至原來的鼠籠中休息4 h，連續(xù)睡眠剝奪7 d。

1.2.2 免疫熒光染色檢測星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR的表達 三組小鼠腹腔注射10%的水合氯醛進行麻醉，麻醉成功后使用冰PBS灌注，直至肝臟變白、自右心耳流出為澄清液體，分離腦組織，先于4%多聚甲醛浸泡過夜固定，再先后置于15%和30%的蔗糖溶液中梯度脫水，脫水成功后切除額極和腦干，包埋腦組織，冰凍切片機下連續(xù)切片，取各組海馬組織切片，每只小鼠各取5片，切片厚度為8 μm。海馬組織切片經(jīng)固定、破膜，與大鼠抗小鼠 α7-nAChR抗體（1:100，Santa Cruz Biotechnology公司）、山羊抗小鼠IBA-1抗體 （1:500，Abcam公司，英國），兔抗小鼠GFAP 抗體（1:1000，Abcam 公司，英國）4℃孵育過夜，次日與山羊抗兔IgG（FITC）（1:1000，Abcam 公司，英國），驢抗大鼠IgG（Alexa Fluor 596）（1:500，Jackson 公司，美國），驢抗山羊 IgG（Alexa Fluor 488）（1:500，Jackson 公司，美國）室溫避光孵育 1h，DAPI封片，免疫熒光顯微鏡觀察，計數(shù)α7-nAChR與星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的共表達的陽性細胞數(shù)。

1.2.3 Western印跡法檢測α7-nAChR蛋白表達分離三組小鼠海馬組織，加入裂解液，使用超聲粉碎，于4℃離心機14000 rpm，離心30 min，吸取上清，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。等量蛋白經(jīng)電泳轉到聚亞乙烯雙氧化物膜（PVDF）上，蛋白條帶加入大鼠抗小鼠α7-nAChR抗體（1：200，Santa Cruz Biotechnology公司）4℃慢搖孵育過夜，次日與HRP標記的山羊抗大鼠IgG抗體（1：5000，北京中杉金橋生物技術有限公司）室溫慢搖孵育1 h，ECL超敏發(fā)光混合液進行凝膠成像拍照。

1.2.4 實時熒光定量PCR（Rt-PCR）檢測α7-nAChR的mRNA表達 分離三組小鼠海馬組織，使用Trizol試劑提取RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度。加入逆轉錄反應體系，將RNA逆轉錄合成cDNA第一條鏈，再向cDNA模板中加入PCR預混液進行PCR擴增，Bio-Rad檢測目的基因的相對表達水平，通過比較CT值獲得目的基因的相對表達水平（見表1）。

表1 α7-nAChR和GAPDH的上下游引物

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料用x±s表示，偏態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（QL，QU）]表示，正態(tài)分布計量資料兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，偏態(tài)分布計量資料的組間比較使用兩獨立樣本秩和檢驗，兩組以上樣本比較進行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗。α＝0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 小鼠海馬組織α7-nAChR蛋白檢測慢性睡眠剝奪7 d后，SD組小鼠海馬組織α7-nAChR蛋白表達量（0.813±0.055）較 CC 組（1.249±0.118）明顯減少，差異具有統(tǒng)計學差異（P=0.001）；慢性睡眠剝奪后腹腔注射PHA-543613后α7-nAChR蛋白表達量（1.065±0.047）較 SD 組（0.813±0.055）升高，差異具有統(tǒng)計學差異（P=0.037）（圖 1，表 2）。

表2 三組小鼠海馬組織α7-nAChR表達量比較（x±s）

圖1 三組小鼠海馬組織α7-nAChR檢測結果及量化比較（n=6） A：蛋白印跡法檢測各組小鼠海馬α7-nAChR蛋白表達；B：α7-nAChR/β-action灰度值的比較，β-action為內(nèi)參

2.2 小鼠海馬組織α7-nAChR mRNA表達的比較慢性睡眠剝奪 7 d后的海馬組織α7-nAChR mRNA 表達量（0.930±0.150）較 CC 組（1.318±0.045）降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.038）；與SD組比較，腹腔注射PHA-543613后α7-nAChR mRNA 表達量（1.524±0.134）升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P=0.002）（圖 2，表 3）。

表3 三組小鼠海馬組織α7-nAChR的mRNA表達量比較

圖2 三組小鼠海馬組織α7-nAChR的mRNA表達的量化比較（n=6）

2.3 α7-nAChR免疫熒光檢測及其在星形膠質(zhì)細胞表面的表達慢性睡眠剝奪后海馬組織星形膠質(zhì)細胞 α7-nAChR 的表達（1.533±0.186）較 CC 組（3.142±0.218）顯著減少，SD+腹腔注射 PHA-543613組海馬組織星形膠質(zhì)細胞α7-nAChR的表達（2.650±0.479）較 SD 組（1.533±0.186）增多，SD組與CC組、SD+PHA組與SD組比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01、P=0.027）。

圖3 免疫熒光染色法檢測小鼠海馬組織α7-nAChR陽性細胞及星形膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR的表達 A、B、C為CC組，D、E、F為 SD 組，G、H、I為 SD+PHA-543613組；A 為 B、C 融合圖，D為 E、F 融合圖，G 為 H、I融合圖；B、E、H 為紅色熒光標記的α7-nAChR，C、F、I為綠色熒光標記的星形膠質(zhì)細胞

2.4 小鼠海馬組織小膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR表達的檢測慢性睡眠剝奪后海馬組織小膠質(zhì)細胞 α7-nAChR 的表達（1.536±0.337）較 CC 組（1.714±0.236） 減少，SD+腹腔注射 PHA-543613組海馬組織小膠質(zhì)細胞α7-nAChR的表達（2.340±0.189）較 SD 組（1.536±0.337）增多，SD 組與 CC組、SD+PHA組與SD組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（見圖 4）。

圖4 免疫熒光染色法檢測小鼠海馬組織小膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR 的表達。A、B、C 為 CC 組，D、E、F為 SD 組，G、H、I為SD+PHA-543613組；A為B、C融合圖，D為E、F融合圖，G為H、I融合圖；B、E、H 為紅色熒光標記的 α7-nAChR，C、F、I為綠色熒光標記的小膠質(zhì)細胞

3 討論

本研究首次探討慢性睡眠剝奪對小鼠海馬組織α7-nAChR表達的影響，實驗結果顯示慢性睡眠剝奪7 d后小鼠海馬區(qū)α7-nAChR基因與蛋白表達減少。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，α7-nAChR主要分布于海馬、丘腦、額葉及皮層等與學習記憶、情感相關的重要腦區(qū)[1]，F(xiàn)REEDMAN等[9]和JESSEN等[10]發(fā)現(xiàn)AD和精神分裂癥患者腦組織內(nèi)α7-nAChR表達減少。這與本研究結果基本一致，研究結果提示海馬組織α7-nAChR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的敏感指標。

α7-nAChR具有神經(jīng)保護作用，體內(nèi)和體外實驗均發(fā)現(xiàn)，α7-nAChR激動劑通過抑制淀粉樣蛋白、谷氨酸、乙醇等代謝毒物的生成發(fā)揮神經(jīng)保護作用[11-14]。研究也發(fā)現(xiàn)α7-nAChR參與膽堿能系統(tǒng)與γ-氨基丁酸系統(tǒng)之間的相互作用，進而引起AD早期認知功能的下降[3]，CONCEPCION等[15]認為α7-nAChR可能是炎癥反應與神經(jīng)退行性疾病之間聯(lián)系的橋梁，因此是多種神經(jīng)變性病的可能治療靶點。在精神分裂癥動物模型中，使用α7-nAChR激動劑后認知功能改善[16]，加蘭他敏也通過激活α7-nAChR改善AD大鼠的認知功能[17]，與既往研究結果相同，在慢性睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動劑PHA-543613后小鼠海馬區(qū)α7-nAChR基因與蛋白表達增多，但α7-nAChR是否以及通過何種機制參與睡眠剝奪后認知功能損傷仍需要進一步研究。

小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的免疫炎性細胞，具有抗原呈遞和產(chǎn)生促炎或抗炎因子等多種功能[18-19]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞與神經(jīng)變性病密切相關[20]，睡眠剝奪模型中，BELLESI等[21]也發(fā)現(xiàn)急性睡眠剝奪和慢性睡眠限制后海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞被激活。α7-nAChR主要表達于神經(jīng)元表面[22-23]，非神經(jīng)元細胞如星形膠質(zhì)細胞[24-25]、小膠質(zhì)細胞[26-27]、NK細胞及內(nèi)皮細胞等[28]也有不同密度α7-nAChR的表達。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，正常情況下小鼠海馬區(qū)的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞表面均有α7-nAChR的表達，星形膠質(zhì)細胞表面 α7-nAChR的表達更多。α7nAChR受體在調(diào)節(jié)巨噬細胞、小膠質(zhì)細胞的炎癥反應中有重要作用，激活α7-nAChR能促進小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉變[29]，進而抑制炎性因子的釋放；星形膠質(zhì)細胞表面的α7-nAChR通過激活Nrf 2信號通路、抑制NF-κB信號通路而發(fā)揮抗炎作用[30]。慢性睡眠剝奪7 d后，海馬區(qū)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表面的α7-nAChR表達亦減少，睡眠剝奪后腹腔注射α7-nAChR激動劑PHA-543613后星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR表達增多?；谌巳旱难芯堪l(fā)現(xiàn)5晚的睡眠限制可使外周血中促炎因子釋放增多，而睡眠恢復后血中促炎因子仍持續(xù)存在[31]，說明睡眠剝奪可以誘導一系列免疫炎癥反應，因此小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞表面的α7-nAChR可能成為限制睡眠剝奪后海馬炎癥和氧化應激的潛在靶點，未來將進一步深入探討膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR在睡眠剝奪中的具體作用機制。

綜上所述，本研究表明慢性睡眠剝奪抑制海馬組織α7-nAChR的表達，降低膠質(zhì)細胞表面α7-nAChR的表達，海馬組織膠質(zhì)細胞α7-nAChR的減少可能是慢性睡眠剝奪后認知功能下降的危險因素，鑒于本研究樣本數(shù)量較少，α7-nAChR在慢性睡眠剝奪的具體機制還需進一步研究。