鄭 姚，王 利，李 娟，豆朋朋，魏 勇

(1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川成都610041；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；3.四川畜牧科學(xué)研究院，四川成都610041)

山羊DQB1基因，即山羊主要組織相容性復(fù)合體II 類基因，屬于山羊白細(xì)胞抗原基因之一，參與機(jī)體肽結(jié)合位點(diǎn)的合成[1-2]。其位于II 類基因的DQ亞區(qū)，編碼β1 肽鏈，被命名為DQB1基因，主要負(fù)責(zé)將外源性抗原多肽片段運(yùn)送至專門識(shí)別與Ⅱ類分子相結(jié)合的抗肽原CD4+T 淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。近年來對(duì)DQB1基因的研究主要集中于人類疾病[3-4]。DQB1 基因能夠顯著地影響動(dòng)物個(gè)體的抵御疾病能力[5-6]。由此可見，DQB1基因作為MHCⅡ類中的一員，在機(jī)體免疫反應(yīng)中有著重要的作用。

金堂黑山羊是經(jīng)自然選擇和人為選育產(chǎn)生的四川省皮肉兼用型優(yōu)良山羊品種。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于羊DQB1基因的研究主要涉及其遺傳的多樣性與免疫相關(guān)性。關(guān)于金堂黑山羊DQB1基因的相關(guān)研究還未見報(bào)道，本研究通過對(duì)金堂黑山羊DQB1基因序列進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)分析，采用熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)該基因的在各組織中的轉(zhuǎn)錄情況，為DQB1 功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 6 月齡健康金堂黑山羊，無菌采集其心臟、肺、脾、肌肉、腸組織，液氮速凍，-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DL2000 DNA Marker、1.1×T3 Super PCR Mix 購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照GenBank 中山羊DQB1基因序列(AY464653.1)，應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物(P1-F：5'-ATGTCTGGGATGCTGGC-3'/P1-R：5'-CGCACGAGCCCCTTCTG-3；P2-F：5'-GTGACCA TCTCCCCATCCA-3'/P2-R：5'-GTCCAGTCCCCGTTC CTAA-3')，參照山羊β-actin 管家基因(JX046106.1)設(shè)計(jì)內(nèi)參引物(P3-F： 5'-CCGTGACATCAAGGAGAAGC-3'/P3-R： 5'-CCGTGTTGGCGTAAAGGT-3')。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。P1 為PCR 引物，P2、P3 為熒光定量PCR 引物，預(yù)期擴(kuò)增長(zhǎng)度分別為785 bp、167 bp、266 bp。

1.3 金堂黑山羊DQB1基因PCR 擴(kuò)增 采用RNAiso Plus 試劑對(duì)金堂黑山羊心臟、肺、脾、肌肉、腸5 種組織充分研磨處理，利用總RNA 提取試劑盒提取組織總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以腸組織cDNA 作為模板，采用P1 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL，PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃2 min；98 ℃2 min 64.5 ℃10 s 72 ℃15 s，共39 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.4 金堂黑山羊DQB1基因生物信息學(xué)分析 采用MegAlign DNAMAN ClustalX 和Mega5.0 等軟件對(duì)DQB1基因進(jìn)行同源性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。采用ExPASy 進(jìn)行蛋白基本理化性質(zhì)分析。采用SignalP4.0 TargetP SOPMA SMART SWISS MODEL預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)功能域及三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 金堂黑山羊不同組織DQB1基因轉(zhuǎn)錄情況的檢測(cè) 以β-actin 為內(nèi)參基因，采用TB Green 熒光染料摻入法檢測(cè)DQB1基因在金堂黑山羊心臟、肺、脾、肌肉、腸等5 種組織中的轉(zhuǎn)錄情況。反應(yīng)體系為10 μL，P2 引物的檢測(cè)反應(yīng)程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、57.3 ℃20 s、72 ℃30 s，39 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。P3 引物的檢測(cè)反應(yīng)程序：95 ℃3 min；95 ℃10 s、56.9 ℃20 s、72 ℃30 s，39 個(gè)循環(huán)；72 ℃2 min。采用2-△△Ct法分析結(jié)果，采用SPSS 24.0 單因素方差分析其顯著性。

2 結(jié)果與討論

2.1 金堂黑山羊DQB1基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果 以金堂黑山羊腸組織cDNA 為模板，采用P1 引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增得到DQB1基因片段(圖1)。分析其開放閱讀框?yàn)?86 bp，可編碼261 aa。序列提交至GenBank 獲得登錄號(hào)為MK294347。表明得到正確的DQB1基因。

2.2DQB1基因同源性分析 近年來，綿羊、牦牛等動(dòng)物的DQB1基因均有報(bào)道[7-8]。本研究結(jié)果顯示，金堂黑山羊DQB1基因與山羊、綿羊、牦牛、馬、白尾鹿、野豬、家犬、人等DQB1基因同源性分別為95.2 %、94.1 %、91.3 %、89.6 %、87.6 %、87.3 %、85.6 %、85.5 %。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示其與山羊聚為一類，親緣關(guān)系最近，與綿羊親緣關(guān)系次之，與家犬、人親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖2)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)金堂黑山羊與山羊DQB1基因編碼的氨基酸序列(AAR97717.1)具有23 個(gè)差異位點(diǎn)。表明DQB1基因表現(xiàn)出高度保守性，同時(shí)保留一定種間特異性，這與有關(guān)學(xué)者研究結(jié)果一致[7,9-10]。

圖1 金堂黑山羊DQB1 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplication of DQB1 gene in Jintang Black Goat by PCR

圖2 DQB1 基因核苷酸系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of DQB1 gene

2.3 DQB1 蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用生物軟件預(yù)測(cè)DQB1 蛋白分子量為29.97 ku，屬于堿性親水性蛋白。發(fā)現(xiàn)其在aa32～aa33 位有信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，具有典型的MHC 分子結(jié)構(gòu)，3 個(gè)結(jié)構(gòu)域(MHC-Ⅱβ 結(jié)構(gòu)域、IGc1 結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域)。表明該蛋白為分泌蛋白、跨膜蛋白。對(duì)該蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與劉秀[9]、張曉芬[10]等研究結(jié)果基本一致，其主要以無規(guī)則卷曲、β- 折疊和α- 螺旋結(jié)構(gòu)形式存在，表明DQB1 蛋白主要以此構(gòu)成蛋白的特異功能部位。

2.4 金堂黑山羊不同組織DQB1基因轉(zhuǎn)錄情況檢測(cè)DQB1基因組織轉(zhuǎn)錄水平的研究未見在山羊中研究報(bào)道，僅在藏綿羊、魚類等有報(bào)道[9,11]。熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，DQB1基因在金堂黑山羊心臟、脾、肌肉、腸、肺5 種組織中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄。DQB1 基因在動(dòng)物組織中分布廣泛，且轉(zhuǎn)錄水平存在一定差異，由高到低依次為心臟、脾、肌肉、腸、肺，在心臟中轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其它組織(p＜0.01)(圖3)。DQB1 位于抗原提呈細(xì)胞巨噬細(xì)胞表面，而心臟巨噬細(xì)胞可以通過膜蛋白參與心電傳導(dǎo)而促進(jìn)心跳[12]，表明DQB1基因可能間接參與心電傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)過程。該結(jié)果與目前已報(bào)道的其它物種相比存在差異，有學(xué)者[11]研究發(fā)現(xiàn)魚類DQB1 基因在脾、腸中轉(zhuǎn)錄水平較高，心臟次之，在肌肉組織轉(zhuǎn)錄水平較低。表明DQB1 基因轉(zhuǎn)錄情況具有一定種間差異，另外可能由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生活于不同環(huán)境，受到諸多不可調(diào)控因素影響，進(jìn)而影響DQB1基因轉(zhuǎn)錄情況。

圖3 DQB1 基因在金堂黑山羊不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 The levels of DQB1 mRNA transcription in different tissues of the goat

綜上所述，本研究克隆了金堂黑山羊DQB1 基因，并對(duì)其進(jìn)行了不同組織轉(zhuǎn)錄水平的分析，為進(jìn)一步研究DQB1 功能及其作用機(jī)制提供參考。