潘孝成　沈?qū)W懷　趙瑞宏　戴銀　胡曉苗　侯宏艷　周學(xué)利　張丹俊

摘要 [目的]克隆和表達(dá)豬流行性腹瀉病毒（PEDV）的N基因。[方法]采用RT-PCR方法對(duì)PEDV FD株的N基因進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物連接pET-28B載體，陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。[結(jié)果]PEDV FD株N基因序列全長(zhǎng)為1 326個(gè)核苷酸，編碼441個(gè)氨基酸;重組N蛋白為可溶性表達(dá)，大小約58 ku;Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。[結(jié)論]該試驗(yàn)制備的PEDV重組N蛋白具有較好的免疫原性，可用于PEDV診斷方法的開發(fā)及相關(guān)研究。

關(guān)鍵詞 豬流行性腹瀉病毒;N蛋白;原核表達(dá)

中圖分類號(hào) S852.65 +7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）17-0091-03

Abstract [Objective] To clone and express the N gene of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV）. [Method] N gene of PEDV FD strain was amplified by RTPCR and clone into pET28B vector， the positive plasmid was transformed into BL21 competent cell of Escherichia coli to? express N protein under IPTG induction. [Result]? N gene of PEDV FD strain contained 1 326 nucleotides in whole length， encoding 441 amino acids. The expressed recombinant N protein was soluble and it was about 58 ku. Westernblot detection results showed that the N protein and PEDV positive sera reacted specifically. [Conclusion] The recombinant N protein of PEDV had a good immunogenicity，which could be used for the? diagnosis method development and research of PEDV.

Key words Porcine epidemic diarrhea virus;N protein;Prokaryotic expression

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種以腹瀉、脫水和嘔吐為特征的傳染病，尤其以哺乳仔豬受害最嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)100%，平均病死率為50%，10日齡內(nèi)哺乳仔豬死亡率可高達(dá)90%，成年豬一般無死亡[1]。PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，為有囊膜的、不分節(jié)段的、單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約28 kb，編碼有纖突（spike，S）蛋白、小膜（small envelope，E） 蛋白、膜（membrane，M） 蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N） 蛋白4種主要結(jié)構(gòu)蛋白[2]。PEDV 的N蛋白由441個(gè)氨基酸組成，主要參與病毒的復(fù)制以及誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，而且在PEDV感染早期宿主能夠產(chǎn)生針對(duì)N蛋白的高水平抗體，因而利用N蛋白建立PEDV診斷技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景[3-6]。筆者對(duì)PEDV FD株的N基因進(jìn)行克隆，原核表達(dá)并純化其N蛋白，旨在為進(jìn)一步建立PEDV的診斷方法提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

PEDV FD株從安徽省肥東縣某發(fā)生豬流行性腹瀉病豬場(chǎng)的仔豬小腸黏膜中分離，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)研究室鑒定和保存。

1.2 主要試劑與菌株

RNAiso Plus試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（M-MLV）、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、IPTG 和X-gal、pET-28B載體等均購自TaKaRa公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）、DNA Marker、蛋白Marker等購自生工生物工程（上海）股份有限公司;其他常用試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.3 PEDV N基因的擴(kuò)增

1.3.1 引物合成。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的PEDV N基因序列，設(shè)計(jì)了1對(duì)引物，P1（NdeI酶切位點(diǎn)）為5′-CTAGCTAGCATGGCTTCTGTCAGCTTTCAGG-3′，P2（XhoI酶切位點(diǎn)）：5′-CCGCTCGAGCCTGTATCGAAGATCTCGTTG-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，擴(kuò)增1 326 bp基因片段，包含PEDV N基因全長(zhǎng)。

1.3.2 RNA提取及cDNA合成。

PEDV FD株細(xì)胞培養(yǎng)液200 μL，按TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA，使用TaKaRa公司1st Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCR擴(kuò)增和測(cè)序。

以合成的cDNA為模板，利用引物對(duì)P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系如下：cDNA 3 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上下游引物各1 μL（10 pmol/μL）、Ex-Taq酶0.5 μL、ddH2O 15 μL;PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 1 min，50 ℃ 50 s，72 ℃ 1.5 min，31個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。電泳鑒定為陽性的PCR產(chǎn)物，使用NdeI和XhoI酶切回收PCR產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物連接pET-28B載體，轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落進(jìn)行培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，將陽性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 PEDV N基因的原核表達(dá)

1.4.1 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)。

將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/ mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃下振蕩培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落接種到含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃220 r/min，培養(yǎng)至 OD600為0.4～0.6，加入 IPTG使終濃度為0.5 mmol/L，15 ℃ 160～170 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液和未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液各1 mL，10 000 r/min 4 ℃高速離心2 min，棄去上清液，加入50 μL PBS后輕輕搖晃離心管，重懸管內(nèi)沉淀，并加入50 μL 2×蛋白電泳Loading Buffer，在冰浴中用超聲波裂解菌體。將超聲波裂解后的液體加入相同體積的 5×上樣緩沖液，混合均勻后沸水煮浴10 min，經(jīng)12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min，取10 μL樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

1.4.2 蛋白表達(dá)形式分析及純化。

將經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液超聲波裂解，經(jīng)12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min后，分別收集上清和沉淀，并將收集到的上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。大量誘導(dǎo)菌液500 mL，經(jīng)超聲波裂解后收集上清，參照蛋白純化說明書操作步驟對(duì)收集的上清過鎳柱純化。

1.4.3 重組蛋白的 Western blot檢測(cè)分析。

蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后，用含5%脫脂奶粉的PBST作為轉(zhuǎn)膜封閉液，4 ℃封閉過夜;將封閉好的NC膜侵泡入200 倍稀釋的PEDV陽性血清，37 ℃孵育1 h;用PBST充分洗滌NC膜，然后浸入用PBST 5 000倍稀釋的羊抗豬IgG-HRP中，37 ℃孵育1 h;PBST充分洗滌后，加入AEC顯色10 min，ddH2O沖洗終止反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV N基因的擴(kuò)增和測(cè)序

以提取的RNA為模板，合成cDNA，用合成的cDNA和引物對(duì)P1/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的基因片段大小約1 300 bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。測(cè)序結(jié)果表明，PEDV FD株N基因序列全長(zhǎng)為1 326個(gè)核苷酸，編碼441個(gè)氨基酸。

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定

將收集的誘導(dǎo)后菌液和未誘導(dǎo)的菌液處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌液有一條大約58 ku的蛋白條帶，與目標(biāo)條帶相符，而未經(jīng)誘導(dǎo)的重組菌未見相應(yīng)蛋白條帶。

2.3 重組蛋白的表達(dá)分析和純化

將經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液超聲波裂解，12 000 r/min 4 ℃高速離心2 min后，分別收集上清液和沉淀，并將收集到的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，可以看出上清液和沉淀均有一條分子量58 ku左右的條帶，且目的蛋白主要在上清液中，表明重組蛋白為可溶性表達(dá);經(jīng)鎳柱純化，獲得單一目的條帶，具體見圖3。

2.4 重組蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果

將過鎳柱純化后的重組N蛋白經(jīng)Western blot分析，結(jié)果顯示在58 ku處出現(xiàn)清晰的反應(yīng)條帶，而陰性對(duì)照無反應(yīng)條帶，表明重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖4）。

3 討論

豬流行性腹瀉病于1971年首次發(fā)現(xiàn)于英國[7]，我國內(nèi)地自20世紀(jì)80年代初以來陸續(xù)有關(guān)于PEDV分離和鑒定的報(bào)道[8]。從2010年末開始，我國東南沿海地區(qū)率先暴發(fā)以新生仔豬嚴(yán)重腹瀉、高發(fā)病率及高死亡率為主要特征的腹瀉疫情，哺乳仔豬的死亡率可達(dá)100%，疫情隨后擴(kuò)散至其他各地，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[9]。2013年美國也開始暴發(fā)仔豬腹瀉疫情，隨后墨西哥、加拿大、韓國以及日本等國家和我國臺(tái)灣地區(qū)[10]也相繼暴發(fā)具有新流行特點(diǎn)的仔豬腹瀉疫情。研究表明，此次全球范圍內(nèi)PED暴發(fā)與PEDV的新變異毒株有關(guān)[11-12]。目前，豬流行性腹瀉病的發(fā)生在我國呈現(xiàn)常態(tài)化[13]，是威脅養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要疫病之一，需要給予高度關(guān)注。

豬流行性腹瀉病毒的N蛋白由441個(gè)氨基酸組成，分子量大小為55～58 ku，在同屬病毒之間的同源性較低，但在同種病毒間具有高度保守性，主要參與病毒的復(fù)制以及誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，可作為早期快速檢測(cè)PEDV感染的一個(gè)重要指標(biāo)[3]。該研究對(duì)PEDV FD株的N基因進(jìn)行了克隆與原核表達(dá)，結(jié)果顯示重組N蛋白為可溶性表達(dá);Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，純化重組N蛋白與PEDV抗體陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明PEDV重組N蛋白具有較好的免疫原性。該研究結(jié)果為開發(fā)PED診斷方法和相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] 殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1997：688-689.

[2] LEE C.Porcine epidemic diarrhea virus：An emerging and reemerging epizootic swine virus[J].Virol J，2015，12：1-16.

[3] 吳玉璐，朱建平，楊莘，等.豬流行性腹瀉病毒 N 基因的表達(dá)及抗原性分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（4）：299-303.

[4] LEE H K，YEO S G.Cloning and sequence analysis of the nucleocapsid gene of porcine epidemic diarrhea virus Chinju99[J].Virus genes，2003，26（2）：207-212.

[5] COLOGNA R，SPAGNOLO J F，HOGUE B G.Identification of nucleocapsid binding sites within coronavirusdefective genomes[J].Virology，2000，277：235-249.

[6] RODK L，VALCˇEK L，MD B，et al.An ELISA optimized for porcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces[J].Vet Microbiol，2005，105（1）：9-17.

[7] PENSAERT M B，DE BOUCK P.A new coronaviruslike particle associated with diarrhea in swine[J].Arch Virol，1978，58（3）：243-247.

[8] 蔡寶祥.介紹幾種新近發(fā)現(xiàn)的豬傳染病[J].畜牧與獸醫(yī)，1982（5）：218-221.

[9] 劉孝珍，陳建飛，時(shí)洪艷，等.2011年豬流行性腹瀉病毒的遺傳變異分析[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（3）：180-183.

[10] 翁善鋼.2014年國際豬病疫情回顧：豬流行性腹瀉在全球的流行與傳播[J].肉類工業(yè)，2015（2）：49-50.

[11] CHEN X，YANG J X，YU F S，et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV）field strains in south China[J].Virus genes，2012，45（1）：181-185.

[12] HUANG Y W，DICKERMAN A W，PIEYRO P，et al.Origin，evolution，and genotyping of emergent porcine epidemic diarrhea virus strains in the United States[J].mBio，2013，4（5）：1-8.

[13] 楊漢春，周磊.2018年豬病流行情況與2019年流行趨勢(shì)及防控對(duì)策[J].豬業(yè)科學(xué)，2019，36（2）：38-40.