張 濤，楊津蘭，朱 安，趙經(jīng)緯，王 旗，2，3

（1.北京大學公共衛(wèi)生學院毒理學系，北京100191；2.國家中醫(yī)藥管理局中藥配伍減毒重點研究室，北京100191；3.食品安全毒理學研究與評價北京市重點研究室，北京100191）

補骨脂酚（bakuchiol）是補骨脂的主要活性成分之一，具有廣泛的藥理活性，如降糖和降血脂作用、抗炎作用［1-3］、抗菌作用［4-8］、抗氧化作用［9-10］、抗癌作用［11-12］和植物雌激素樣作用［13-15］等，在治療糖尿病、肝硬變、乳腺癌和絕經(jīng)后骨質疏松等方面具有較大的應用潛力。張昀等［16］研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂酚在雌、雄性大鼠體內(nèi)的代謝速率有差異。趙子婧等［17-18］對SD大鼠ig給予補骨脂水煎液（40 g·kg-1）和補骨脂酚（200 mg·kg-1），發(fā)現(xiàn)補骨脂酚在雌、雄性大鼠體內(nèi)的毒代動力學參數(shù)存在明顯差異，雌性大鼠血漿清除率均慢于雄性大鼠。補骨脂酚在大鼠體內(nèi)代謝動力學過程有性別差異，迄今為止未見其在人體內(nèi)代謝的研究報道。體外代謝研究中，焦士勇等［19］研究了補骨脂酚在雄性大鼠、比格犬和人肝微粒體中細胞色素P450（cytochrome P450，CYP）酶的代謝穩(wěn)定性和代謝動力學，并比較了種屬差異。除了CYP 酶參與補骨脂酚的代謝外，Li 等［20］研究表明，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGT）也參與了補骨脂酚的代謝。目前尚無CYP酶和UGT酶同時參與補骨脂酚的體外代謝研究報道。研究該2種酶對補骨脂酚的代謝性質和性別差異，有助于了解其在體內(nèi)的代謝，對指導臨床合理用藥具有重要意義。本研究應用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法，研究補骨脂酚在大鼠和人肝微粒體中CYP酶和UGT酶介導的代謝反應的代謝穩(wěn)定性，并比較代謝的性別和種屬差異。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器

補骨脂酚購自南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，純度＞99%。丹參酮ⅡA（內(nèi)標）、奧美拉唑（CYP2C19特異性底物）和丙甲菌素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；奧沙西泮標準溶液（1 g·L-1）（UGT2B15 特異性底物）購自英國LGC 公司；Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒購自美國Thermo Scientific 公司；雌、雄性SD 大鼠肝微粒體和男、女性人肝微粒體購自北京匯智泰康生物技術有限公司，蛋白濃度為20 g·L-1；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、尿苷-5′-二磷酸葡萄糖醛酸（uridine 5′-diphosphoglucuronic acid，UDPGA）和D-葡萄糖二酸1，4-內(nèi)酯（一水）購自美國Sigma 公司；甲醇和乙腈為色譜純，購自美國Fisher 公司；DMSO 購 自 美 國Amresco 公 司；甲 酸、KH2PO4、K2HPO4·3H2O 和MgCl2·6H2O 均為國產(chǎn)分析純，實驗用水為超純水。Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；Ultimate XS-C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Welch公司）；FLUO star Omega 多功能酶標儀（德國BMG LABTECH公司）；十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries 公司）；Thermo Micro 17R 高速冷凍離心機（美國Thermo Scientific 公司）；Milli-Q 純水器（美國Millipore 公司）；KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 肝微粒體代謝孵育體系

1.2.1 NADPH啟動的Ⅰ相代謝反應體系

孵育體系用100 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，含MgCl25 mmol·L-1）配制，孵育總體積為200 μL，其中含肝微粒體（終濃度為0.5 g·L-1）和補骨脂酚（初始濃度為10 μmol·L-1）。上述孵育體系在37 ℃預孵育5 min，加預孵育5 min的NADPH（終濃度為1 mmol·L-1）溶液啟動Ⅰ相代謝反應。孵育體系中DMSO不超過0.1%。

1.2.2 UDPGA啟動的Ⅱ相代謝反應體系

孵育體系用100 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，含MgCl25 mmol·L-1）配制，孵育總體積為200 μL，其中含肝微粒體（終濃度為0.5 g·L-1）、丙甲菌素（終濃度為25 mg·L-1）、D-葡萄糖二酸1，4-內(nèi)酯（終濃度為5 mmol·L-1）和補骨脂酚（初始濃度為10 μmol·L-1）。先將孵育體系置冰上15 min，為內(nèi)質網(wǎng)膜“打孔”活化葡萄糖醛酸轉移酶，然后在37℃預孵育5 min，加預孵育5 min的UDPGA（終濃度為5 mmol·L-1）溶液啟動Ⅱ相代謝反應。孵育體系中DMSO不超過0.1%，甲醇不超過0.1%。

1.2.3 NADPH 和UDPGA 共同啟動的兩相代謝反應體系

孵育體系加入在37℃預孵育5 min 的NADPH（終濃度為1 mmol·L-1）和UDPGA（終濃度為5 mmol·L-1）溶液啟動兩相代謝反應，其余同Ⅱ相代謝反應體系。

1.3 孵育方案和樣品處理

上述各孵育體系在37℃水浴中進行孵育，分別于0，2，5，10，20，30 和60 min 加冰冷的200 μL 含內(nèi)標（0.5 μmol·L-1丹參酮ⅡA）的甲醇-乙腈（1∶1，V∶V）溶液終止反應，0 時組用滅活的微粒體代替正常微粒體。渦旋混勻2 min，于17 000×g，4℃離心15 min，各取上清20 μL HPLC進樣分析，檢測各時間點補骨脂酚的剩余量。

1.4 HPLC法測定條件

流動相為甲醇-0.1%甲酸水（89∶11，V∶V），流速為1 mL·min-1，柱溫為30℃，檢測波長262 nm，進樣量20 μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理和分析

以0 min時的補骨脂酚濃度為100%，計算不同時間點的補骨脂酚剩余濃度，與0 min 時濃度相比得到其剩余百分比。用GraphPad Prism 7 軟件自建單指數(shù)降解模型，詳見式（1），各時間點補骨脂酚剩余百分比為Y，時間為X，對數(shù)據(jù)進行非線性擬合，求得底物消除速率常數(shù)（-k），由式（2）得到補骨脂酚的代謝消除半衰期t1/2，按式（3）和式（4）計算補骨脂酚的固有清除率Clint和肝清除率Clh［21］。

其中，WML表示每g肝組織中含有的微粒體蛋白的平均質量（mg·g-1），WLB表示每kg體質量中肝的平均質量（g·kg-1），Qh表示肝血流量（mL·min-1·kg-1），c蛋白表示反應體系中的蛋白質濃度（g·L-1），相關參數(shù)值引自文獻［22］（表1）。

Tab.1 Parameters in hepatic clearance calculation

2 結果

2.1 HPLC檢測方法學驗證

2.1.1 專屬性

HPLC 圖譜見圖1，微粒體中的內(nèi)源性物質不干擾補骨脂酚和內(nèi)標的測定，補骨脂酚和內(nèi)標可完全分離且峰形良好，保留時間分別為7.9和9.1 min。

2.1.2 線性范圍和檢測限

用最小二乘法進行線性回歸，求得回歸方程Y=0.7763X+0.3202，R2=0.9935，補骨脂酚在0.2～20 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好，測定下限為0.2 μmol·L-1。

2.1.3 準確度和精密度

測定的日內(nèi)和日間精密度＜8.5%，準確度在-4.6%～17.8%的范圍內(nèi)，提取回收率＞98%，表明本研究采用的樣品測定方法準確可靠，符合要求。

2.2 補骨脂酚在大鼠和人肝微粒體中的代謝

不加NADPH 或UDPGA 時，補骨脂酚在大鼠和人肝微粒體中不發(fā)生代謝（圖2A和B），表明其肝微粒體代謝是NADPH/UDPGA 依賴的。補骨脂酚分別與不同性別、種屬肝微粒體孵育，其代謝消除曲線見圖2。補骨脂酚在SD 大鼠和人肝微粒體中均會發(fā)生CYP酶介導的Ⅰ相反應和UGT酶介導的Ⅱ相反應，且代謝反應速率存在性別、種屬差異。通過非線性擬合得到底物消除速率常數(shù)（-k），計算補骨脂酚在肝微粒體中的消除半衰期t1/2和固有清除率Clint，推導得到肝清除率Clh，其代謝參數(shù)見表2和表3。

Fig.1 HPLC chromatograms of bakuchiol in liver microsomes.A：blank rat liver microsomes；B：blank rat liver microsomes spiked with bakuchiol；C：incubation of bakuchiol with rat liver microsomes；1：bakuchiol；2：internal standard；mAU：mili absorbance unit.

Fig.2 Gender differences in metabolic elimination profiles of bakuchiol in rat liver microsomes（RLMs）and human liver microsomes（HLMs）without nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH）and uridine 5′-diphosphoglucuronic acid（UDPGA）（A，B）and in presence of NADPH（C，D），UDPGA（E，F(xiàn)）or both of them（G，H）.Bakuchiol（10 μmol·L-1）was incubated with liver microsomes at the protein content of 0.5 g·L-1 and other constituents.After 0，2，5，10，20，30 and 60 min of incubation at 37℃，the reactions were stopped by addition of 200 μL methanol-acetonitrile（1∶1）containing 0.5 μmol·L-1 tanshinone ⅡA（internal standard）.After vortexing for 2 min，the sample was centrifuged at 17 000×g for 15 min（4℃）.A 20 μL aliquot of the supernatant was analyzed by HPLC.s，n=3.

Tab.2 Metabolic clearance parameters of bakuchiol in RLMs

Tab.3 Metabolic clearance parameters of bakuchiol in HLMs

在SD 大鼠肝微粒體中，補骨脂酚經(jīng)CYP 酶介導的Ⅰ相代謝反應Clint，雄性〔（326.6±15.4）mL·min-1·kg-1〕顯著高于雌性〔（77.2±4.8）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；UGT 酶介導的Ⅱ相代謝反應Clint，雌性〔（419.1±24.1）mL·min-1·kg-1〕顯著高于雄性〔（164.5±8.4）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；兩種酶同時介導的聯(lián)合代謝反應Clint，雄性〔（1063.1±27.2）mL·min-1·kg-1〕顯著高于雌性〔（781.2±16.5）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）。

在人肝微粒體中，補骨脂酚經(jīng)CYP酶介導的Ⅰ相代謝反應Clint，男性〔（24.8±2.1）mL·min-1·kg-1〕顯著高于女性〔（17.6±1.0）mL·min-1·kg-1〕（P＜0.01）；UGT 酶 介 導 的Ⅱ相 代 謝 反 應Clint，男 性〔（176.4±26.5）mL·min-1·kg-1〕和女性〔（165.9±8.6）mL·min-1·kg-1〕無顯著性別差異；兩種酶同時介導的聯(lián)合代謝反應Clint，男性〔（262.5±20.9）mL·min-1·kg-1〕和女性〔（236.2±10.5）mL·min-1·kg-1〕無顯著性別差異。

3 討論

在參與藥物代謝的各類酶中，CYP酶為主要代謝酶（75%），其次為UGT 酶（15%）［23］。李艾芳等［24］、胡 小 婧 等［25］和Chi 等［26］研 究 結 果 表 明，CYP1A2，CYP2C9，CYP2C19 和CYP3A4 均參與了補骨脂酚的代謝。Li等［20］研究結果提示，UGT1A1，UGT1A3 和UGT2B15 為補骨脂酚的主要代謝酶。因此，對補骨脂酚的體外代謝酶研究應重點關注CYP 酶和UGT酶。本研究通過體外代謝穩(wěn)定性實驗，對補骨脂酚分別在不同性別SD 大鼠和人肝微粒體發(fā)生CYP 酶、UGT 酶介導及兩者同時介導的代謝反應進行系統(tǒng)考察，并比較代謝酶貢獻差異及代謝的種屬和性別差異。

本研究表明，SD 大鼠肝微粒體對補骨脂酚的代謝清除具有顯著性別差異，雄性SD 大鼠肝微粒體對補骨脂酚的代謝以CYP 酶介導的Ⅰ相反應為主，雌性SD 大鼠肝微粒體發(fā)生的代謝以UGT 酶介導的Ⅱ相反應為主。當該兩種酶同時介導、發(fā)生聯(lián)合代謝反應時，雄性Cl顯著快于雌性。本課題組趙子婧等測定SD大鼠iv給予補骨脂酚50 mg·kg-1的血漿藥動學參數(shù)，雄、雌性SD大鼠的清除率分別為4.96±1.58和（3.98±0.58）L·h-1·kg-1（待發(fā)表），本研究結果與此相近〔3.15±0.00和（3.09±0.00）L·h-1·kg-1〕，提示補骨脂酚在大鼠體內(nèi)以CYP酶和UGT酶介導的代謝反應為主。補骨脂酚在雄、雌性SD 大鼠肝微粒體中發(fā)生的代謝反應主要類型及代謝速率均出現(xiàn)顯著的性別差異，這可能與參與補骨脂酚代謝的酶在雄、雌性SD大鼠體內(nèi)含量不同有關［27］。

與大鼠肝微粒體不同，補骨脂酚在人肝微粒體中發(fā)生的代謝主要類型和代謝速率的性別差異較小，僅CYP酶介導的Ⅰ相代謝反應出現(xiàn)顯著的性別差異，男性代謝略快于女性。由于參與補骨脂酚Ⅰ相反應的主要CYP 酶，如CYP2C19，CYP1A2 和CYP3A4，均表現(xiàn)出明顯的基因多態(tài)性，尤其是CYP2C19最為典型［28］。因而對于不同性別的人肝微粒體，參與補骨脂酚代謝的CYP同工酶活性可能存在差異，從而影響其代謝速率。由于補骨脂酚在人肝微粒體中發(fā)生的代謝以代謝速率無顯著性別差異的Ⅱ相代謝反應為主，當這兩種酶同時作用時，補骨脂酚的代謝速率仍無顯著性別差異，提示補骨脂酚在人體內(nèi)的代謝可能無顯著性別差異。補骨脂酚具有一定的肝和腎細胞毒性［29-31］，在人體內(nèi)雖可較快地進行代謝消除，由于其脂溶性較高，有可能會在人體中產(chǎn)生蓄積，對肝、腎功能產(chǎn)生損害作用。長期用藥時，仍需要警惕補骨脂酚潛在的肝和腎毒性風險。

藥物代謝大多在肝中進行，體外肝微粒體代謝法是研究藥物體外代謝的主要技術和方法，常采用雄性大鼠或男性人肝微粒體進行體外代謝研究。由于CYP酶參與了大多數(shù)藥物的代謝，對代謝酶的考察也常優(yōu)先考察CYP 酶的代謝作用。本研究表明，對于多種酶參與代謝的藥物，如補骨脂酚，僅研究其在大鼠或人肝微粒體中發(fā)生CYP 酶介導的代謝反應，會嚴重低估其在大鼠或人體內(nèi)實際的代謝速率，從而對其代謝作出錯誤的判斷。因此，當使用藥物的體外代謝實驗數(shù)據(jù)預測其在體內(nèi)的代謝時，需首先考察各種酶對藥物是否具有代謝作用，在此基礎上盡可能將參與代謝的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶納入研究范疇，以免對藥物的實際代謝情況作出錯誤的評估。對于體內(nèi)代謝研究，將大鼠的研究結果進一步外推至人體時，需要注意在大鼠體內(nèi)代謝有性別差異的藥物，在人體內(nèi)代謝不一定也存在性別差異。