任艷利 牛之函 劉琳玉 劉遠(yuǎn)芳

摘 要：目的：研究椒蒿精油對植物病原真菌的抑制作用，探索其在抑菌方面的功能，為天然抗菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。方法：以椒蒿精油為原料，采用菌絲生長速率法，測定其對5種植物病原真菌的抑菌作用。結(jié)果：濃度為5.0μL/mL的椒蒿精油處理5d，對灰葡萄孢菌有100%的抑制作用。最低抑菌濃度（MIC）測定顯示，椒蒿精油對5種供試菌的抑制作用從強(qiáng)到弱依次為灰葡萄孢菌>油菜菌核病菌>辣椒疫霉病菌>棉花枯萎病菌>菜豆炭疽病菌。結(jié)論：椒蒿精油對植物病原真菌具有良好的抑制作用，在農(nóng)藥領(lǐng)域中，用椒蒿精油防治植物病原真菌具有很好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：椒蒿精油;植物病原真菌;菌絲生長;抑菌作用

中圖分類號 R284文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）16-0085-05

Abstract：To study the inhibitory effect of Artemisia essential oil on plant pathogenic fungi and explore its antibacterial function，so as to provide a theoretical basis for the development of natural antimicrobial agents. The antibacterial activity of Artemisia essential oil was study by the method of mycelial growth rate，which was used to 5 plant pathogenic fungi. The treatment of 5d with Artemisia essential oil，a volume fraction of 5.0μL/mL showed a 100% inhibitory effect on Botrytis cinerea. The determination of minimum inhibitory concentration （MIC） showed that the inhibition effect of Artemisia essential oil on 5 kinds of tested bacteria from strong to weak were，Brassica sclerotiorum、Sclerotinia sclerotiorum、 Phytophthora capsici，F(xiàn)usariurn oxysporum f、Colletotrichum linde-muthianum. The results showed that the essential oil of Artemisia had a good inhibitory effect on plant pathogenic fungi，and it had good application potential in controlling plant pathogenic fungi with Artemisia essential oil in the field of pesticide.

Key words：Essential oils;Plant pathogenic fungi;Mycelial growth;Antibacterial function

植物精油（Essential oils，Eos），又稱揮發(fā)油（volatile oils），屬于植物次生代謝產(chǎn)物[1]中的萜類化合物，多是單萜和倍半萜。其廣泛分布于植物界，存在于腺細(xì)胞和表皮中，具有強(qiáng)烈的氣味和香味，可防止害蟲侵襲[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，由植物病原真菌引起的病害約占植物病害總數(shù)的70%～80%。精油對真菌等微生物有著強(qiáng)烈的抑制作用或是對其有很強(qiáng)的殺傷力。眾多研究表明，生姜精油、紅蔥頭精油、蓼子樸花精油、百里香精油、薰衣草精油、檸檬精油、羅勒精油對植物病原菌均有不同程度的抑制作用[3-11]。除了對植物病原菌有抑制作用外，植物精油對一些真菌和毒素也有抑制作用[12-15]，除此之外，植物精油在臨床上已被用于治療一些疾病[16，17]，在保鮮技術(shù)方面也發(fā)揮著一定的功效[18-21]。

新疆維吾爾自治區(qū)擁有豐富的藥用植物資源，尤其是位于中亞地區(qū)的伊犁河谷一帶地處內(nèi)陸高寒地帶，氣候濕潤、雨量充沛，獨(dú)特的自然條件孕育了超過1000種的藥用植物資源，是藥用植物在新疆分布最多的區(qū)域。椒蒿（Artemisia dracunculus L.），為菊科龍蒿植物，半灌木狀草本。在新疆博爾塔拉蒙古自治州的精河縣、溫泉縣，哈密地區(qū)巴里坤哈薩克自治縣，伊犁哈薩克自治州察布查爾錫伯自治縣等地，都有野生椒蒿資料分布。椒蒿含揮發(fā)油，尤其是幼嫩的頂芽中含有豐富的揮發(fā)油。

隨著人類健康和環(huán)保意識的不斷增強(qiáng)，低毒、高效的抑菌劑已成為了國內(nèi)外學(xué)者研發(fā)的熱點(diǎn)。研究表明：芳香植物精油有一定的殺菌、殺蟲能力，被認(rèn)為是極具開發(fā)潛力的新一代植物源農(nóng)藥。在農(nóng)藥殘留危害日漸加劇、植物病原菌對化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的嚴(yán)峻形勢下，精油可作為一種亟待開發(fā)的新型殺菌物質(zhì)進(jìn)行研究[8-12]。為此，本研究開展了椒蒿精油對幾種主要植物病原真菌的抑菌效果試驗，采用菌絲生長速率法，測定不同精油濃度對菌絲生長的相對抑制率，并測定精油最低抑菌濃度（MIC），為植物精油類新型殺菌物質(zhì)的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 椒蒿精油：2018年5月份于察布查爾縣孫扎齊鄉(xiāng)雀兒盤村采樣，由伊犁師范大學(xué)楊嘵絨副教授鑒定為椒蒿。椒蒿頂芽部分自然風(fēng)干后，粉碎后以水作為溶劑，用揮發(fā)油提取器采用水蒸氣蒸餾法提取8h獲得。供試菌種：棉花枯萎病菌[（Fusariurn oxysporum f. sp. Vasinfectum （Atk.） Snyder &Hansen）]、灰葡萄孢菌（Botrytis Cinerea）、油菜菌核病菌[（Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary）]、辣椒疫霉病菌（Phytopthora capsici）、菜豆炭疽病菌（Colletotrichum linde-muthianum），均由伊犁師范大學(xué)焦子偉老師提供。供試病菌由PDA固體培養(yǎng)基培養(yǎng)并備用。

1.2 方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基配制 稱取去皮土豆200g，切成小塊放入鍋中，加水1000mL，加熱至沸騰，維持20～30min，用6層紗布趁熱在量杯上過濾，濾渣棄取。濾液補(bǔ)充水分到1000mL，加入葡萄糖20g、瓊脂粉20g，小火加熱至瓊脂完全溶解后，再補(bǔ)充水分至所需量。121℃滅菌20min。

1.2.2 含精油培養(yǎng)基的配制 用瓊脂稀釋法結(jié)合菌絲生長速率法對椒蒿精油的抑菌活性進(jìn)行測定。準(zhǔn)確吸取不同體積的椒蒿精油與0.1%吐溫-80充分混合，乳化好的精油混合液加入已冷卻至50℃左右的PDA固體培養(yǎng)基中，在無菌環(huán)境中倒人培養(yǎng)皿中，得到椒蒿精油終濃度分別為0.625、1.25、2.5、5.0μL/mL的培養(yǎng)基。同時，制備不含精油的PDA培養(yǎng)平板作為對照。

1.2.3 接種培養(yǎng) 用直徑7mm的無菌打孔器取在PDA平板上培養(yǎng)4～7d的供試病原菌，并將其移植到上述含不同濃度的精油平板和空白對照（不含精油）的中央，每皿1塊。將培養(yǎng)皿倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d，從第1天開始，每天用十字交叉法測量供試菌菌落的直徑，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算抑制率。計算公式如下：

生長速率（mm/d）=（菌落直徑-7mm）/培養(yǎng)天數(shù);

抑制率（%）=（對照生長速率-處理生長速率）/

對照生長速率×100

通過抑制率的大小，可判定椒蒿精油各菌落的抑菌活性等級。較強(qiáng)抑制：相對抑制率≥70%以上;中等強(qiáng)度抑制：相對抑制率40%～70%;較弱抑制：≤40%[13]。

1.2.4 最低抑制濃度（MIC）測定 根據(jù)上一步試驗結(jié)果，采用瓊脂稀釋法測定椒蒿精油對不同病原菌的最低抑菌濃度（MIC）。將乳化好的不同體積精油溶液倒入已融化好的培養(yǎng)基中混合均勻。在無菌條件下倒入培養(yǎng)皿中，使平皿中精油的最終濃度分別為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL/mL。對照組中加入等體積吐溫-80。取直徑7mm的病原菌菌餅，將其接種到上述不同處理的培養(yǎng)皿中央，每個處理3次重復(fù)，在28℃條件下培養(yǎng)48h，對接種的菌種生長情況進(jìn)行觀察。測量菌落直徑，計算抑制率。與對照組相比，以菌落完全沒有生長的最低精油濃度為其MIC，有肉眼可見菌落生長者為無抑菌作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 椒蒿精油對棉花枯萎病原菌菌絲生長的抑制作用 如圖1所示：與空白對照相比，經(jīng)椒蒿精油處理的棉花枯萎病菌菌絲的生長速率減小，隨著精油濃度的逐步加大，菌絲的生長速率越來越小。隨著處理時間的增加，抑制效果逐漸減弱。精油濃度為5.0μL/mL時，棉花枯萎菌在前3d未見生長，第4～5天菌絲的生長速率分別為1.2、2.0mm/d，菌絲生長的抑制率分別為88%、78.82%，這個濃度的精油表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為2.5μL/mL時，棉花枯萎菌在前2d未見生長，第3～5天菌絲的生長速率分別為1.9、2.1、3.28mm/d，菌絲生長的抑制率分別為83.18%、79%、68.21%，這個濃度的精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為1.25μL/mL時，第2～5天菌絲的生長速率分別為2.85、3.07、3.73、4.54mm/d，菌絲生長的抑制率分別為75%、72.83%、62.7%、51.7%，這個濃度的精油表現(xiàn)出了中等抑制作用。精油濃度為0.625μL/mL時，棉花枯萎菌在第2～5天的菌絲生長速率分別為4、5.1、5.5、6.1mm/d，與對照相比有明顯差異，菌絲生長的抑制率分別為64.91%、54.87%、45%、35.11%。與對照差異一般，表現(xiàn)出了較弱的抑制作用。

2.2 椒蒿精油對灰葡萄孢菌的抑制作用 如圖2所示，精油濃度為5.0μL/mL、2.5μL/mL、1.25μL/mL、0.625μL/mL時，處理樣5d內(nèi)未見灰葡萄胞菌生長，生長速率為0，這幾個濃度的精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)100%。

2.3 椒蒿精油對油菜菌核病菌菌絲生長的抑制作用 如圖3所示，精油濃度為5.0μL/mL時，油菜菌核病菌在前3d未見生長，第4～5天菌絲的生長速率分別為0.55、0.72mm/d，菌絲生長的抑制率分別為86.9%、83.63%，這個濃度的精油表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為2.5μL/mL時，油菜菌核病菌在第1～2天未見生長，第3～5天菌絲的生長速率分別為0.5、1.12、1.2mm/d，菌絲生長的抑制率分別為76.84%、73.3%、70.7%，這個濃度的精油抑菌活性較明顯。精油濃度為1.25μL/mL時，第2～5天菌絲的生長速率分別為0.85、1.4、1.63、1.74mm/d，菌絲生長的抑制率分別為73.84%、65.15%、61.19%、58.18%，這個濃度的精油表現(xiàn)出中等的抑制作用。精油濃度為0.625μL/mL時，油菜菌核病菌在第2～5天菌絲的生長速率分別為1.35、1.9、2.45、2.52mm/d，與對照有明顯差異，菌絲生長的抑制率分別為58.46%、50%、41.67%、36.21%，與對照差異一般，表現(xiàn)出了較弱的抑制作用。

2.4 椒蒿精油對辣椒疫霉病菌菌絲生長的抑制作用 如圖4所示，精油濃度為5.0μL/mL時，辣椒疫霉病菌在前4d未見生長，第5天菌絲的生長速率為0.6mm/d，菌絲生長的抑制率為87.44%，這個濃度的精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為2.5μL/mL時，辣椒疫霉病菌在第1～2天未見生長，第3～5天菌絲的生長速率分別為0.83、1.13、1.38mm/d，菌絲生長的抑制率分別為80%、74.49%、70.87%，這個濃度的精油表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為1.25μL/mL時，第2～5天菌絲生長的速率分別為1.45、1.8、1.95、2.12mm/d，菌絲生長的抑制率分別為62.33%、56.83%、55.98%、53.71%，這個濃度的精油抑菌差異不明顯。精油濃度為0.625μL/mL時，辣椒疫霉病菌在第2～5天菌絲的生長速率分別為1.4、2.2、2.48、2.76mm/d，與對照有明顯差異，菌絲生長的抑制率分別為63.63%、47.24%、44.02%、39.74%，與對照差異一般，表現(xiàn)出了較弱的抑制作用。

2.5 椒蒿精油對菜豆炭疽病菌菌絲生長的抑制作用 如圖5所示，在整個試驗過程中，菜豆炭疽病菌的生長速率較快，第5天菌落直徑接近6cm。當(dāng)精油濃度為5.0μL/mL時，菜豆炭疽病菌在前3d未見生長，第4～5天菌絲的生長速率分別為0.63、1.34mm/d，菌絲生長的抑制率分別為87.75%、80.31%，這個體積分?jǐn)?shù)的精油表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抑制作用。精油濃度為2.5μL/mL時，菜豆炭疽病菌在第1～3天未見生長，第4～5天菌絲的生長速率分別為3.18、3.94mm/d，菌絲生長的抑制率分別為68.45%、62.69%，這個濃度的精油表現(xiàn)中等抑制作用。精油濃度為1.25μL/mL時，第3～5天菌絲的生長速率分別為3.8、6.95、7.36mm/d，菌絲生長的抑制率分別為59.87%、31.05%、30.3%，這個濃度的精油抑菌活性差異不明顯。精油濃度為0.625μL/mL時，菜豆炭疽病菌在第2～5天菌絲的生長速率分別為2.6、6.6、7.75、8.7mm/d，與對照有明顯差異，菌絲生長的抑制率分別為63.63%、30.31%、23.12%、17.61%。與對照差異一般，表現(xiàn)出了較弱的抑制作用。

2.6 最低抑菌濃度（MIC） 采用瓊脂稀釋法，將不同量的椒蒿精油加入融化并冷至50℃左右的定量PDA瓊脂中，制成含最終精油濃度為7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5、2.0μL/mL的平板，接種以上5種植物病原菌，孵育后觀察受試菌生長情況，每一個濃度做3組平行試驗，最終確定其MIC。如表1所示，椒蒿精油對灰葡萄胞菌菌的抑制作用最強(qiáng)，最低抑菌濃度（MIC）最低為3.0μL/mL，對菜豆炭疽病菌的抑制效果最弱，最低抑菌濃度最高為6.0μL/mL。可見，椒蒿精油對5種植物病原菌的最低抑菌濃度為灰葡萄孢菌>油菜菌核病菌>辣椒疫霉病菌>棉花枯萎病菌>菜豆炭疽病菌。

3 結(jié)論

本次試驗結(jié)果表明，椒蒿精油對5種植物病原菌的生長均具有一定的抑制作用，且抑菌效果隨精油濃度的增加而增加。當(dāng)椒蒿精油濃度在5.0μL/mL下處理5d，可完全抑制灰葡萄孢菌的生長，其抑制率達(dá)到100%;當(dāng)椒蒿精油濃度在2.5μL/mL下處理5d，對油菜菌核病菌有較強(qiáng)的抑制作用;當(dāng)椒蒿精油濃度在1.25μL/mL下處理5d，對油菜菌核病菌、辣椒疫霉病菌、棉花枯萎病菌有中等的抑制作用;當(dāng)椒蒿精油濃度在0.625μL/mL下處理5d，對菜豆炭疽病菌有較弱的抑制作用。

4 討論

植物精油和化學(xué)抑菌劑相比，具有殘留毒性和副作用小的特點(diǎn)，同時其顯著的抑菌活性和廣泛的抑菌范圍，抑菌研究方面受到了廣泛的關(guān)注，被認(rèn)為是開發(fā)天然防腐保鮮劑和化妝品防腐劑的重要原料[20]。隨著植物精油及其主成分對植物病原菌抑菌機(jī)制研究的日漸深入，使得農(nóng)藥研究領(lǐng)域日益關(guān)注利用精油對植物病原菌進(jìn)行防治。利用天然抗菌劑對植物病原菌進(jìn)行防治越來越受到了廣泛的關(guān)注，劉凡等[8]研究發(fā)現(xiàn)，熏衣草精油幾種植物病原真菌有明顯的抑制作用;吳克剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，香辛植物精油對常見呼吸道致病菌有明顯的抑制作用;王芳等[22]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂精油對成團(tuán)泛菌和腐生葡萄球菌有一定的抑制作用。

本研究僅開展了椒蒿精油對5種植物病原真菌的抑菌活性研究，對其他植物病原真菌是否也有抑菌活性還有待進(jìn)一步驗證;本研究僅進(jìn)行了體外的抗菌活性檢測，后期要繼續(xù)進(jìn)行體內(nèi)的抑菌活性檢測。此外，在椒蒿生長的不同時期（返青期、生長期、花蕾期、結(jié)實(shí)期），不同部位（頂芽、莖、根）精油的化學(xué)成分和含量都有很大的區(qū)別[23]。下一步要對不同時期、不同部位的精油的主要成分進(jìn)行抑菌試驗，以便進(jìn)一步確定椒蒿精油中的主要抑菌成分。另外，當(dāng)前學(xué)者們對椒蒿精油的研究主要集中在抗氧化作用，對椒蒿精油抗真菌作用機(jī)理的研究尚處于起步階段，對將其開發(fā)成新型果蔬保鮮劑的研究也鮮有涉及，以及椒蒿精油單個組分及幾種組分復(fù)合作用的抑菌效果仍需進(jìn)一步研究。全面掌握椒蒿精油抑制微生物生長的確切組分和機(jī)制，將擴(kuò)大椒蒿精油的綜合利用。

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（責(zé)編：張宏民）