殷鴻洋，趙 遠(yuǎn)，鄭 義，保 聰，黃新新，丁英杰，蔡 強(qiáng)*

（1.常州大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.浙江清華長三角研究院，浙江 嘉興 314006；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；4.瓦赫寧根大學(xué)海洋動(dòng)物生態(tài)組，荷蘭 6708WD；5.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海200135）

隨著工農(nóng)業(yè)發(fā)展，重金屬的排放和農(nóng)藥的使用對環(huán)境和生物造成了嚴(yán)重的影響。原環(huán)境保護(hù)部和原國土資源部發(fā)布的全國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)顯示，鎘、銅污染物點(diǎn)位超標(biāo)率分別為7.0%和2.1%[1]。雖然銅是生命體生長發(fā)育所必需的微量元素，但是過量的銅會(huì)對動(dòng)植物體產(chǎn)生毒害作用，鎘則有明顯的毒害作用[2]。銅、鎘等重金屬污染一旦進(jìn)入環(huán)境和生物體內(nèi)則難以降解[3-4]。我國是農(nóng)業(yè)大國，農(nóng)藥的使用量居世界第一，每年達(dá)50～60萬t，最終進(jìn)入環(huán)境的農(nóng)藥達(dá)使用量的80%～90%[5]。雖然可以使用中低毒的農(nóng)藥代替劇毒、高殘留農(nóng)藥，但是低毒農(nóng)藥對環(huán)境中的生物仍存在毒性影響。在我國，中低毒農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯都是最常用的殺蟲劑[6-7]，用于農(nóng)業(yè)害蟲防治的殺螟丹對魚類胚胎毒性較高[8]，螺蟲乙酯則會(huì)對水生生物產(chǎn)生不利影響[9-12]。

生態(tài)環(huán)境中常出現(xiàn)混合污染的情況，其中農(nóng)業(yè)活動(dòng)常造成重金屬和農(nóng)藥各組分之間的相互影響，并共同作用于生物體產(chǎn)生聯(lián)合毒性。例如草甘膦常與波爾多液共同使用以控制植物的霉病，這可能導(dǎo)致草甘膦和銅的復(fù)合污染[13]。耕種過程中過量使用磷肥會(huì)造成鎘污染[14]，超量加入重金屬到飼料中也會(huì)使動(dòng)物糞便和秸稈混合的有機(jī)肥料存在重金屬污染[15]。

重金屬與農(nóng)藥的復(fù)合污染在環(huán)境中普遍存在，銅、鎘與殺螟丹、螺蟲乙酯的復(fù)合污染不可避免，雖然已有學(xué)者對這4種污染物的單一毒性效應(yīng)和機(jī)理做了研究，但是重金屬與中低毒農(nóng)藥聯(lián)合毒性研究還很少。本試驗(yàn)采用費(fèi)氏弧菌為受試生物，研究重金屬銅、鎘與殺螟丹、螺蟲乙酯構(gòu)成的二元混合體系的聯(lián)合毒性，通過混合毒性指數(shù)法（MTI法）評價(jià)其聯(lián)合毒性效應(yīng)，為重金屬和農(nóng)藥復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估和環(huán)境保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）凍干粉，菌株符合國際標(biāo)準(zhǔn)，由浙江清華長三角研究院提供，-20℃避光保存。將胰蛋白胨、酵母膏、甘油、磷酸氫二胺、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉配制成培養(yǎng)液，分裝到50 mL的錐形瓶中，滅菌30 min。將上述培養(yǎng)至對數(shù)期的發(fā)光細(xì)菌分裝至離心管中，4℃、5000 r·min-1離心10 min，棄去上清液，收集菌體。將菌體重新懸浮于含一定濃度氯化鈉和脫脂牛奶、蔗糖等保護(hù)劑的溶液中，分裝于安瓿瓶中，每瓶0.5 mL，于-70℃預(yù)凍3 h，真空冷凍干燥24 h后封口。

Cu（NO3）2濃度為 1000 mg·L-1；Cd（NO3）2濃度為1000 mg·L-1；ZnSO4·7H2O純度為99.5%；殺螟丹農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度為98.1%；螺蟲乙酯標(biāo)樣純度為99.0%；NaCl和丙酮均為分析純。如無特殊說明，以上試劑均采用去離子水稀釋。

細(xì)胞培養(yǎng)板（WHB-24），美國康寧公司；微孔板型多功能檢測儀（E7031），美國普洛麥格公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

用1 mL 2%NaCl溶液復(fù)蘇費(fèi)氏弧菌凍干粉，復(fù)蘇至發(fā)光穩(wěn)定且發(fā)光強(qiáng)度到100萬光子數(shù)，再稀釋至10 mL，振蕩混勻。

1.2.1 單一毒性實(shí)驗(yàn)

將樣品稀釋為5個(gè)設(shè)定的質(zhì)量濃度，每個(gè)濃度3次平行，設(shè)置陰性質(zhì)控（空白對照，2%NaCl溶液）和陽性質(zhì)控（10 mg·L-1ZnSO4·7H2O溶液）。在96孔板中加入復(fù)蘇并稀釋后的菌液20 μL，用微孔板型多功能檢測儀測試發(fā)光菌的初始發(fā)光強(qiáng)度，測試合格后，每孔加入180 μL的受試樣品，20℃恒溫反應(yīng)15 min和30 min后測其發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算抑制率為10%和90%時(shí)對應(yīng)的樣品濃度，設(shè)為正式實(shí)驗(yàn)的濃度范圍區(qū)間。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的質(zhì)量濃度范圍，設(shè)計(jì)10個(gè)幾何級數(shù)質(zhì)量濃度梯度，每個(gè)濃度3組平行，并設(shè)置空白對照和陽性質(zhì)控，參照預(yù)實(shí)驗(yàn)方法，測試反應(yīng)15 min和30 min后的發(fā)光強(qiáng)度，并計(jì)算EC50。

1.2.2 聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯對費(fèi)氏弧菌的單一毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以15 min EC50值為1個(gè)毒性單位，按等毒性單位比1∶1、1∶2和2∶1設(shè)計(jì)銅-殺螟丹、鎘-殺螟丹、銅-螺蟲乙酯、鎘-螺蟲乙酯的二元聯(lián)合毒性試驗(yàn)。測定不同毒性單位比的混合物對費(fèi)氏弧菌15、30、45、60、75、90 min的EC50。

1.3 混合毒性指數(shù)法計(jì)算聯(lián)合毒性

式中：TUi為混合物中i組分的毒性單位；Ci為混合物中對生物產(chǎn)生半抑制影響的i組分濃度；EC50i為受試樣本i的單一EC50值；TUi，max為混合物中所有組分毒性單位的最大值；MTI為混合毒性指數(shù)。

根據(jù)MTI值對聯(lián)合毒性的類型進(jìn)行判斷：MTI＜0，拮抗作用；MTI=0，獨(dú)立作用；0＜MTI＜1，部分相加作用；MTI=1，簡單相加作用；MTI＞1，協(xié)同作用[16]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過對比陰性質(zhì)控樣發(fā)光強(qiáng)度與受試樣本發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算受試樣本對費(fèi)氏弧菌的抑制率，對相同暴露時(shí)間、不同濃度的抑制率進(jìn)行曲線擬合，并計(jì)算各受試樣本的EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一毒性

實(shí)驗(yàn)中陽性質(zhì)控10 mg·L-1ZnSO4·7H2O對費(fèi)氏弧菌的抑制率在40%～60%，陰性質(zhì)控2%NaCl對費(fèi)氏弧菌的校正系數(shù)Cf值均在0.6～1.8之間，符合費(fèi)氏弧菌凍干粉水質(zhì)檢測的國際標(biāo)準(zhǔn)ISO 11348-3和GB/T 15441—2012。受試樣品中丙酮的濃度為0.5%，對費(fèi)氏弧菌的抑制率低于2%。

重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯對費(fèi)氏弧菌的單一毒性結(jié)果如圖1和圖2所示。重金屬銅、鎘對費(fèi)氏弧菌的毒性很強(qiáng)，暴露15 min后的EC50值分別為0.53 mg·L-1和0.74 mg·L-1，30 min后的EC50值分別為0.51 mg·L-1和0.67 mg·L-1，屬于劇毒毒性。農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯相比銅、鎘對費(fèi)氏弧菌的毒性較低，屬于中低毒性。殺螟丹對費(fèi)氏弧菌15 min和30 min的EC50值分別為79.06 mg·L-1和55.68 mg·L-1，螺蟲乙酯對費(fèi)氏弧菌15 min和30 min的EC50值分別為116.68 mg·L-1和105.25 mg·L-1。

圖1 重金屬銅和鎘對費(fèi)氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 1 The 15 min and 30 min EC50of heavy metal copper and cadmium to Vibrio fischeri

2.2 聯(lián)合毒性

重金屬銅、鎘和農(nóng)藥殺螟丹、螺蟲乙酯的二元聯(lián)合毒性結(jié)果列于表1和表2，采用MTI法評價(jià)暴露不同時(shí)間后混合物聯(lián)合毒性的結(jié)果列于表3至表6。

銅-殺螟丹的混合體系中，當(dāng)毒性單位比為1∶1時(shí)，15 min和30 min的聯(lián)合毒性評價(jià)結(jié)果為部分相加作用，表明其聯(lián)合毒性介于獨(dú)立和相加作用之間，而在45 min表現(xiàn)為簡單相加作用，60 min后表現(xiàn)為協(xié)同作用，說明毒性隨時(shí)間增加而增強(qiáng)。配比為1∶2時(shí)，前45 min的評價(jià)結(jié)果相同，均為拮抗作用，表明兩種物質(zhì)聯(lián)合毒性小于各物質(zhì)單獨(dú)毒性之和，說明毒性有所減弱。但是隨著時(shí)間的增長，混合物對費(fèi)氏弧菌的毒性增強(qiáng)，由拮抗變?yōu)椴糠窒嗉幼饔?。配比?∶1時(shí)，隨著時(shí)間的增長，聯(lián)合毒性由拮抗變?yōu)楹唵蜗嗉印?/p>

圖2 農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯對費(fèi)氏弧菌作用15 min和30 min的EC50Figure 2 The 15 min and 30 min EC50of pesticides cartap and spirotetramat to Vibrio fischer

表1 銅-殺螟丹、鎘-殺螟丹二元混合體系對費(fèi)氏弧菌的EC50值Table 1 The EC50of binary mixtures of copper-cartap and cadmium-cartap

表2 銅-螺蟲乙酯、鎘-螺蟲乙酯二元混合體系對費(fèi)氏弧菌的EC50值Table 2 The EC50of binary mixtures of copper-spirotetramat and cadmium-spirotetramat

表3 銅-殺螟丹二元混合體系聯(lián)合毒性評價(jià)Table 3 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-cartap

表4 鎘-殺螟丹二元混合體系聯(lián)合毒性評價(jià)Table 4 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-cartap

鎘-殺螟丹的混合體系中，隨著暴露時(shí)間的增長，聯(lián)合毒性由拮抗作用變?yōu)橄嗉幼饔?，?5 min時(shí)毒性明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為部分相加，隨后的暴露時(shí)間里，毒性小幅增長。

銅-螺蟲乙酯的混合體系中，毒性單位比為1∶2時(shí)，混合物對費(fèi)氏弧菌表現(xiàn)為拮抗作用，隨著時(shí)間的增長，拮抗作用減弱。毒性單位比為1∶1和2∶1時(shí)，混合物對費(fèi)氏弧菌的聯(lián)合毒性為部分相加作用。

表5 銅-螺蟲乙酯二元混合體系聯(lián)合毒性評價(jià)Table 5 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of copper-spirotetramat

表6 鎘-螺蟲乙酯二元混合體系聯(lián)合毒性評價(jià)Table 6 Evaluation of joint toxicity of binary mixtures of cadmium-spirotetramat

鎘-螺蟲乙酯的混合體系中，毒性單位比為1∶1時(shí)，15 min和30 min表現(xiàn)為獨(dú)立作用，隨后毒性增強(qiáng)，表現(xiàn)為部分相加作用。毒性單位比為1∶2時(shí)，表現(xiàn)為拮抗作用。毒性單位比為2∶1時(shí)，隨著時(shí)間的增長，聯(lián)合毒性從拮抗作用變?yōu)椴糠窒嗉幼饔谩?/p>

3 討論

從圖1可得出受試樣本對費(fèi)氏弧菌的毒性順序?yàn)殂~＞鎘，毒性順序與其他生物如蚯蚓、人體等不同，可能是因?yàn)殂~對水生細(xì)菌的毒性較大[17]。本研究中銅、鎘對費(fèi)士弧菌的毒性大小順序與Tong等[18]和Mansour等[19]研究結(jié)果相同，但EC50值與其研究的數(shù)值有差異，可能是因?yàn)橘M(fèi)氏弧菌的發(fā)光強(qiáng)度與其他因素（如溫度、鹽度、細(xì)菌質(zhì)量濃度）有關(guān)。

圖2中，殺螟丹的毒性大于螺蟲乙酯，這與兩種物質(zhì)在其他生物體的毒性順序相同。殺螟丹對南亞野鯪的 96 h LC50為 0.36 mg·L-1[20]，周勝利[8]用 98% 殺螟丹原藥對斑馬魚胚胎進(jìn)行暴露，發(fā)現(xiàn)96 h LC50為0.28 mg·L-1，而螺蟲乙酯對非洲鯰魚胚胎的急性毒性LC50為8.44 mg·L-1[6]，從兩種物質(zhì)對于魚類胚胎的急性毒性LC50可以發(fā)現(xiàn)殺螟丹毒性大于螺蟲乙酯。暴露15 min后，4種物質(zhì)對費(fèi)氏弧菌的單一毒性大小順序?yàn)殂~＞鎘＞殺螟丹＞螺蟲乙酯，暴露30 min，毒性大小順序未發(fā)生改變且差異不顯著，因此不再延長暴露時(shí)間。

殺螟丹、螺蟲乙酯在與重金屬銅、鎘聯(lián)合時(shí)，會(huì)抑制銅、鎘的毒性，出現(xiàn)拮抗和部分相加作用。在表3和表4重金屬與殺螟丹的毒性單位比為1∶2和2∶1的混合體系中，當(dāng)殺螟丹占比較大時(shí)，聯(lián)合毒性減弱，這可能是因?yàn)闅⒚?xì)胞膜有損傷作用[21]，抑制了費(fèi)氏弧菌對銅、鎘的吸收從而降低了毒性。在表5和表6重金屬和螺蟲乙酯的毒性單位比為1∶2和2∶1的混合體系中，螺蟲乙酯在混合體系中占比越大，則拮抗作用越強(qiáng)，這可能是因?yàn)槁菹x乙酯抑制了費(fèi)氏弧菌的生長，降低了其機(jī)體能量平衡和代謝相關(guān)基因的表達(dá)，降低了細(xì)胞膜的通透性[22]，從而降低了銅、鎘滲入細(xì)胞膜內(nèi)所產(chǎn)生的毒害作用。

在4種混合體系中，隨銅、鎘在混合體系中占比增加，聯(lián)合毒性增強(qiáng)，且在暴露45 min后聯(lián)合毒性有較為明顯的增強(qiáng)，說明殺螟丹和螺蟲乙酯可能只是減緩了銅、鎘進(jìn)入費(fèi)氏弧菌的速率。在費(fèi)氏弧菌為受試生物探究重金屬與農(nóng)藥聯(lián)合毒性的實(shí)驗(yàn)中，常以15 min和30 min時(shí)的EC50作為聯(lián)合毒性的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[23]。在殺螟丹、螺蟲乙酯和重金屬的聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于農(nóng)藥減緩了重金屬進(jìn)入費(fèi)氏弧菌的時(shí)間，因此應(yīng)延長對費(fèi)氏弧菌的暴露時(shí)間至45 min以上。

從4種混合體系的聯(lián)合毒性評價(jià)中可以明顯看到，隨著時(shí)間的增長毒性增強(qiáng)。污染物的毒性隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化，不同的污染物隨時(shí)間可能有不同的毒性變化規(guī)律[24]。如Zhu等[25]采用濃度-時(shí)間-效應(yīng)曲面研究了6種三嗪類除草劑對Q67的毒性，發(fā)現(xiàn)其毒性具有明顯的時(shí)間依賴性，即毒性隨著時(shí)間的延長而逐漸增加，但不同毒物的毒性增幅不同。此外，混合體系類型、混合配比對聯(lián)合作用效應(yīng)也會(huì)產(chǎn)生影響。如螺蟲乙酯占比較高時(shí)，會(huì)抑制重金屬進(jìn)入細(xì)胞，部分表現(xiàn)為拮抗作用；當(dāng)螺蟲乙酯占比較低時(shí)，則表現(xiàn)為部分相加作用。因此在實(shí)際的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中，要結(jié)合實(shí)際殘留量來加以分析。

綜上所述，殺螟丹與重金屬的混合體系中，最終表現(xiàn)為相加作用或協(xié)同作用。雖然在混合體系中較高濃度的螺蟲乙酯會(huì)抑制重金屬離子的毒性，但實(shí)際水環(huán)境的農(nóng)藥殘留和重金屬混合體系中，螺蟲乙酯殘留常占比較低，因此實(shí)際情況仍體現(xiàn)了毒性增強(qiáng)。殺螟丹和螺蟲乙酯在國內(nèi)外廣泛使用，如殺螟丹占到湄公河三角洲稻米和稻田養(yǎng)殖場殺蟲劑使用量的19%[26]，且我國土壤環(huán)境和水環(huán)境中銅、鎘含量普遍較高。農(nóng)藥殘留和重金屬都能通過降雨侵蝕和地表徑流進(jìn)入水生環(huán)境并共同作用于水生生物產(chǎn)生聯(lián)合毒性。因此，雖然單一物質(zhì)毒性相對較低，但是隨著暴露時(shí)間的增長，殺螟丹、螺蟲乙酯與銅、鎘的聯(lián)合毒性仍不容忽視，其中殺螟丹與重金屬的聯(lián)合毒性風(fēng)險(xiǎn)更大。

4 結(jié)論

在充分暴露的條件下，殺螟丹、螺蟲乙酯與銅、鎘聯(lián)合毒性增強(qiáng)，整體表現(xiàn)為相加作用或協(xié)同作用，但當(dāng)螺蟲乙酯在混合體系中所占毒性單位比較大時(shí)，表現(xiàn)為拮抗作用。

由于農(nóng)藥能減緩金屬離子進(jìn)入費(fèi)氏弧菌的速率，因此農(nóng)藥殺螟丹和螺蟲乙酯與重金屬銅、鎘的聯(lián)合暴露，體現(xiàn)為暴露初期重金屬毒性受到抑制，而后聯(lián)合毒性緩慢增強(qiáng)。采用發(fā)光細(xì)菌法評價(jià)聯(lián)合毒性時(shí)，應(yīng)將暴露時(shí)間從30 min延長至45 min以上。殺螟丹和螺蟲乙酯雖是中低毒農(nóng)藥，但與重金屬銅、鎘混合時(shí)，對水生生物產(chǎn)生的聯(lián)合毒性增強(qiáng)，并需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)判定長期暴露的毒性。