談明東 劉宗昭 李艷紅 王超 高洪波

1.新疆中信國(guó)安葡萄酒業(yè)有限公司 新疆瑪納斯 832200

2.北京輕工技師學(xué)院 北京 100071

3.國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院 北京 100037

4.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京 100015

生物胺（Biogenic Amines）是一類具有生理活性的低分子含氮有機(jī)化合物，呈堿性，通常存在于動(dòng)、植物體內(nèi)和食品（尤其是發(fā)酵食品）中。適量的生物胺是生物體（包括人體）生理代謝中的正常活性成分，在生物活性細(xì)胞中具有重要功能，其中多胺對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖具有重要作用。生物胺還是合成荷爾蒙、核酸、蛋白質(zhì)等的前體，但也是生成致癌物質(zhì)的前體。但是，攝入量超過一定范圍的生物胺時(shí)，則會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，出現(xiàn)頭疼、腹瀉和嘔吐等不良反應(yīng)。生物胺在人體細(xì)胞內(nèi)會(huì)被一些酶促代謝反應(yīng)降解，但酒精和乙醛能抑制這些酶的活性，從而降低脫毒效率。生物胺中以組胺對(duì)人體健康影響最大，許多國(guó)家規(guī)定了葡萄酒中組胺的限量范圍，其中德國(guó)2mg/L，比利時(shí)5-6mg/L，瑞士和澳大利亞10mg/L，法國(guó)8mg/L，荷蘭3mg/L。葡萄果實(shí)和葡萄酒中均有生物胺的檢出[1]。大量研究表明，生物胺的種類和含量受品種、產(chǎn)地、年份、氣候、土壤、栽培管理、品種及成熟度等因素影響。更多學(xué)者認(rèn)為葡萄酒中生物胺的主要來(lái)源是蘋乳發(fā)酵。蘋乳發(fā)酵過程中，葡萄酒中的生物胺前體氨基酸減少，組胺、腐胺等生物胺的含量顯著升高。

為了探索降低葡萄酒中生物胺的含量，減少其對(duì)人體健康的危害，本研究以天山北麓瑪納斯小產(chǎn)區(qū)新疆的‘馬瑟蘭’葡萄為原料，通過監(jiān)測(cè)粒選冷浸漬工藝和穗選常溫浸漬工藝兩種不同前處理方式在葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量的變化規(guī)律，結(jié)合感官評(píng)價(jià)確定葡萄酒的品質(zhì)優(yōu)劣，為今后降低葡萄酒中生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘馬瑟蘭’葡萄：瑪納斯產(chǎn)區(qū)，樹齡8年；D活性干酵母，上海杰兔提供；LALVIN31乳酸菌，法國(guó)拉曼生產(chǎn)。甲醇、丙酮（色譜純）：美國(guó)Fisher公司；丹磺酰氯、精胺、亞精胺、組胺、酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺、色胺（色譜純）：美國(guó)Sigma公司。

1.2 設(shè)備及儀器

高效液相色譜儀7980A：美國(guó)安捷倫；PAL-SPME自動(dòng)進(jìn)樣器：美國(guó)安捷倫；瑞士CTCAnalytics；AE240電子天平：梅特勒-托利多；pH計(jì)FiveEasyPlus梅特勒-托利多；BUCHERVaslin粒選除梗機(jī)（法國(guó)型號(hào)DeltaOscillys）。

1.3 方法

（1）‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒釀造工藝流程。馬瑟蘭葡萄穗選除根破碎浸漬酒精發(fā)酵蘋乳發(fā)酵原酒穗選、粒選除梗破碎冷浸漬

注：粒選冷浸漬（BSCM）工藝流程圖；穗選常溫浸漬（CSHM）工藝流程圖；

本實(shí)驗(yàn)取樣時(shí)間點(diǎn)：滿罐樣品取樣Y1；浸漬結(jié)束添加酵母時(shí)取樣Y2；酒精發(fā)酵結(jié)束后取樣Y3；蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束取樣Y4，分別對(duì)兩種工藝上述節(jié)點(diǎn)生物胺的含量進(jìn)行分析比較[2]。

（2）感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)GB15037-2006制定相應(yīng)的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

（3）試驗(yàn)方法。

①樣品前處理。將取樣點(diǎn)留取的葡萄酒樣品分別取按照參考王瑞等方法進(jìn)行樣品處理備用。

②生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制。同樣按照參考王瑞等方法進(jìn)生物胺標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置。

（4）高效液相色譜條件。色譜條件：AgilentXDB-C18色譜柱（150mm×4.6nm，5μm），柱溫30℃，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相A：色譜甲醇，流動(dòng)相B：超純水，流速：1.0mL/min，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

（5）定性定量分析。①定性分析。在相同色譜條件下，對(duì)照色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺、腐胺、亞精胺和精胺共8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖出峰時(shí)間，對(duì)樣品中各生物胺進(jìn)行定性分析（圖1）。

②定量分析。通過HPLC色譜檢測(cè)葡萄酒樣品中各生物胺的峰面積，根據(jù)8種生物胺標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算葡萄酒樣品中各生物胺的含量[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒釀造過程中生物胺含量變化

由表2看出檢測(cè)的8種生物胺，在不同的發(fā)酵工藝中：BSCM產(chǎn)生的生物胺的總量明顯低于CSHM；生物胺的總量分別是25.309mg/L和38.739mg/L。與王瑞等文獻(xiàn)報(bào)道相比處于中等偏下。報(bào)道中新疆不同產(chǎn)區(qū)中生物胺總含量分別為：天山北麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒樣品中生物胺總含量在10.28～130.57mg/L，焉耆盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在49.93-64.67mg/L，吐哈盆地產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66-168.60mg/L，伊犁河谷產(chǎn)區(qū)生物胺總含量在9.66-226.13mg/L。

2.2 各生物胺在不同工藝中的含量變化

8種生物胺具有共同的特點(diǎn)是：CSHM較BSCM發(fā)酵過程中8種生物胺含量均呈上升趨勢(shì)，并且增加最快的階段均在Y3-Y4即蘋-乳發(fā)酵期間，色胺在兩種工藝中在進(jìn)罐破碎過程中生物胺的含量變化不大，在酒精發(fā)酵后明顯增加分別是2.0561mg/L、3.568mg/L，蘋乳發(fā)酵結(jié)束后的含量增加較大分別是4.857mg/L、9.865mg/L，明顯冷浸漬工藝中的增加量少。除色胺外，其余7種生物胺在冷浸漬和酒精發(fā)酵階段中的變化較小，組胺和腐胺、尸胺和苯乙胺在發(fā)酵各階段變化趨勢(shì)相近最終的含量也比較接近。綜上所述：色胺在‘馬瑟蘭’葡萄酒中受發(fā)酵工藝影響最大；組胺、亞精胺和腐胺的次之；酪胺、精胺和亞精胺最小[3]。

2.3 感官評(píng)價(jià)結(jié)果

將葡萄酒樣品于低溫避光通風(fēng)處?kù)o置儲(chǔ)存30d后，由10名國(guó)家級(jí)品酒員和釀酒師進(jìn)行感官質(zhì)量品評(píng)，按20分葡萄酒評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行品嘗打分評(píng)價(jià)如表3。

表3中評(píng)分顯示，BSCM色澤、香氣、口感分項(xiàng)評(píng)分中均高于CSHM。綜合評(píng)價(jià)中，兩種‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒均酒體外觀呈鮮亮的紫紅色，香氣以水果香氣、藍(lán)莓味、紫羅蘭味為主，橡木香氣為輔。兩種干紅感官區(qū)別在于CSHM酒香濃郁度較低，酒體平衡協(xié)調(diào)，單寧略顯粗糙；BSCM酒香復(fù)雜有層次感，空腔舌頭有收斂感，酒體堅(jiān)實(shí)有力，平衡且復(fù)雜，單寧略有澀感，此差異主要原因在于發(fā)酵前處理工藝不同。

3 討論

目前，大多數(shù)研究者認(rèn)為生物胺的產(chǎn)生主要與氨基酸脫羧酶的活性有關(guān)，而與其含量關(guān)系較小，且乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性，可使氨基酸轉(zhuǎn)化為生物胺，因此乳酸菌是影響葡萄酒中生物胺含量的主要微生物。本研究中根據(jù)檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示，8種生物胺含量增加最大的為蘋乳發(fā)酵階段。酪胺、腐胺、亞精胺、精胺等4中生物胺在酒精發(fā)酵階段開始已經(jīng)產(chǎn)生，酒精發(fā)酵中酵母也會(huì)帶入一部分生物胺，這可能會(huì)抑制乳酸菌的活性；葡萄醪（汁）中氨基酸的濃度也會(huì)在一定程度上影響生物胺的產(chǎn)生量，在一定范圍內(nèi)，濃度越大產(chǎn)生物胺越多，本實(shí)驗(yàn)中在浸漬階段苯乙胺和腐胺含量也有所增加。本實(shí)驗(yàn)兩種工藝BSCM、CSHM酒中組胺分別是6.061mg/L、8.296mg/L，冷浸漬工藝產(chǎn)生的總生物胺含量低，冷浸澤工藝可以抑制生物胺的產(chǎn)生，與Smit等研究結(jié)果一致葡萄酒中生物胺的含量與葡萄品種、原料產(chǎn)地等也有一定關(guān)系。因此在降低氨基酸的產(chǎn)生和減緩乳酸菌脫羧酶的活性，可以降低生物胺的產(chǎn)生.

表2 ‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒發(fā)酵過程中生物胺含量變化（mg/L）

表3 不同工藝處理‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒感官質(zhì)量品評(píng)得分表

圖1 液相色譜自動(dòng)衍生檢測(cè)8種生物胺

4 結(jié)語(yǔ)

本文通過采用粒選低溫冷浸漬發(fā)酵工藝（BSCM）和穗選常溫浸漬發(fā)酵工藝（CSHM）獲得的‘馬瑟蘭’干紅葡萄酒，分別進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和利用高效液相色譜法檢測(cè)兩種工藝中生物胺的含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在整個(gè)發(fā)酵過程中，生物胺含量整體呈上升趨勢(shì)，在酒精發(fā)酵和蘋乳發(fā)酵階段生物胺含量迅速增加，總含量由葡萄醪液中的2.112、2.112mg/L升高至25.309、38.739mg/L；從蘋乳發(fā)酵前后的數(shù)據(jù)看出，蘋乳發(fā)酵是生物胺生成的主要階段。兩款葡萄酒中色胺含量最高，最高可達(dá)到4.857和9.865mg/L，色胺為此葡萄酒中主要產(chǎn)物。酪胺含量雖是含量最低的生物胺，但其含量分別是0.464和0.204mg/L。其中BSCM中生物胺總量和最高含量的色胺均小于CSHM中的。

部分生物胺在蘋乳發(fā)酵結(jié)束時(shí)呈上升趨勢(shì)，因此在蘋乳發(fā)酵結(jié)束后，隨著這個(gè)時(shí)期有殺菌作用的游離SO2的減少，要及時(shí)抑菌、除菌，來(lái)降低葡萄酒中的生物胺含量。為優(yōu)化生產(chǎn)工藝，控制發(fā)酵條件，從而降低葡萄酒中的生物胺含量提供理論基礎(chǔ)。