馬少鴻，黃郁蔥，簡紀(jì)常，蔡雙虎

哈維氏弧菌基因的克隆及原核表達(dá)分析

馬少鴻，黃郁蔥，簡紀(jì)常，蔡雙虎

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東 湛江 524088）

【】對哈維氏弧菌（）ZJ0603的基因進(jìn)行克隆與原核表達(dá)分析，優(yōu)化表達(dá)條件?？寺」S氏弧菌菌株ZJ0603的基因，對其編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)、信號肽、亞細(xì)胞定位、二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)分析，構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-，經(jīng)HI和I雙酶切和測序鑒定正確后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株大腸桿菌BL21，對表達(dá)重組菌株進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化及Western Blot鑒定?；虻拈_放閱讀框（ORF）全長為1 179 bp，編碼336個氨基酸，分子質(zhì)量為38.04 ku，理論等電點5.27，不穩(wěn)定系數(shù)41.97，總平均親水性-0.382，PspF蛋白整體表現(xiàn)為親水性蛋白。成功構(gòu)建含pET28a-的表達(dá)菌株，其最佳誘導(dǎo)條件為37 ℃下異丙基---硫代半乳糖苷（IPTG） 0.2 mmol/L誘導(dǎo)6 h，其表達(dá)蛋白為38 ku。Western Blot結(jié)果表明PspF重組蛋白成功獲得，蛋白同源性高，具有作為抗弧菌病疫苗的潛力。

哈維氏弧菌；基因；原核表達(dá)；表達(dá)優(yōu)化

哈維氏弧菌（）是一種主要分布于海洋的革蘭陰性菌，兼性厭氧，嗜鹽，是多種海水動物的常見致病菌[1]，其在適宜溫度下可快速生長繁殖為優(yōu)勢菌種，通過口、鰓及體表等途徑侵染養(yǎng)殖動物[2]，致使養(yǎng)殖動物大批量死亡，在大西洋棘白鯧（）[3]、對蝦（）[4]、石斑魚（sp）[5]、大黃魚（）[6]和線紋海馬（）[7]等多種養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)動物都爆發(fā)過大規(guī)模弧菌病，嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

PspF蛋白為噬菌體休克蛋白（Phage shock protein）操縱子轉(zhuǎn)錄激活因子，其能激活噬菌體休克蛋白系統(tǒng)表達(dá)[8]。噬菌體休克蛋白系統(tǒng)是一種應(yīng)激反應(yīng)途徑，能夠感知和響應(yīng)細(xì)胞膜的損傷，由PspABCD操縱子和PspG基因組成[8]，在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄是由含有替代因子σ54的DNA依賴性RNA聚合酶驅(qū)動[9]，廣泛存在于臨床相關(guān)的如大腸桿菌（）、耶爾森氏菌（）和霍亂弧菌（）[10-12]等革蘭陰性細(xì)菌中。的表達(dá)是組成型表達(dá)，且可自我負(fù)調(diào)控，在細(xì)胞內(nèi)低濃度表達(dá)，控制著操作子和的表達(dá)[13-16]。在大腸桿菌中，PspA與PspF蛋白相互結(jié)合形成抑制復(fù)合物，Psp系統(tǒng)處于沉默狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激，會導(dǎo)致PspA重新定位到細(xì)胞質(zhì)膜，與PspBC復(fù)合，也可能通過直接的膜接觸，PspF誘導(dǎo)PspA表達(dá)，導(dǎo)致PspA、-B和-C濃度增加，PspA和PspD控制ArcB/ArcA系統(tǒng)的活性水平從而感知細(xì)胞的氧化還原/代謝狀態(tài)[17]，在細(xì)菌應(yīng)激緩解中發(fā)揮作用。

目前，對Psp系統(tǒng)的研究報道主要集中在大腸桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和霍亂弧菌（）等革蘭陰細(xì)菌[9-11]的結(jié)構(gòu)功能及作用機(jī)理方面，對于哈維氏弧菌噬菌體休克蛋白系統(tǒng)中PspF蛋白的研究尚處于空白階段。本研究擬首次從哈維氏弧菌基因組擴(kuò)增出基因，利用生物信息學(xué)分析初步分析其PspF蛋白表征，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒菌株，優(yōu)化表達(dá)菌株的表達(dá)條件，以期為哈維氏弧菌PspF蛋白作為亞單位疫苗的可能性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 哈維氏弧菌菌株ZJ0603分離自患病斜帶石斑魚（）并保存于廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室。實驗中所用克隆載體為Takara pMD18-T，感受態(tài)細(xì)胞為北京全式金生物公司生產(chǎn)的大腸桿菌（）Transα和BL21（DE3），表達(dá)載體pET-28a由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Easy Pure PCR Purification Kit試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（Easy Pure Plasmid MiniPrep Kit）購自賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）公司；Premix RxTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶和QuickCut限制酶購自Takara公司；卡那霉素、氨芐青霉素、IPTG和TTBS購自海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆 參考細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取哈維氏弧菌ZJ0603的基因組。根據(jù)GenBank上已公布的弧菌基因序列，分別設(shè)計含HI和I酶切位點的上下游引物，上游引物F：5′-CGGGATCCATGAAGCAAAACC TCATCGGT-3′（HI），下游引物R: 5′-CCCTCG AGTTATCCT TGACCAACTAAGCCAT -3′（I）。以哈維氏弧菌的全基因組為模板鏈擴(kuò)增基因，PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件為 95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53.2 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的目的片段用純化試劑盒純化，再將純化產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，16 ℃連接2 h后轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞transα，經(jīng)無抗性的LB液體培養(yǎng)1 h后涂布于添加了質(zhì)量濃度為100 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，序列鑒定由廣州生工生物公司完成。

1.2.2生物信息學(xué)分析 在線網(wǎng)站NCBI ORF finder獲得目的基因的開放閱讀框和蛋白的氨基酸序列， ExPASy PASy-Prot分析PspF蛋白的理論等電點、疏/親水性情況、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)；Signal P 4.1 Server測序預(yù)測PspF蛋白的信號肽的存在情況；Psort.hgc預(yù)測PspF蛋白的亞細(xì)胞定位；SOPMA和SWISS-MODEL分別分析其二級結(jié)構(gòu)和三級空間結(jié)構(gòu)，對氨基酸序列進(jìn)行蛋白序列BLAST比對，ClustalW軟件分析其同源性。

1.2.3 表達(dá)載體pET28a-的構(gòu)建 參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書對測序正確的pMD18T-和 pET-28a載體分別提取質(zhì)粒用HI和I酶切后經(jīng)T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)中。經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后涂布平板，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定為陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后送廣州生工生物公司測序，保證新構(gòu)建表達(dá)載體pET28a-在表達(dá)中不會發(fā)生移碼。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將含pET28a-重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21（DE3）以體積分?jǐn)?shù)1.0%接種量接種于LB液體培養(yǎng)基（含100 μg/mL kan+），37 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔1 h測一次(600 nm)值。當(dāng)(600 nm)達(dá)0.4~0.6時，向培養(yǎng)基中加1 mmol/L 誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以不誘導(dǎo)的含pET28a-的 BL21（DE3）為對照組。37 ℃再次震蕩培養(yǎng)4 h后離心收集菌液，PBS洗凈后水煮法提取細(xì)菌蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分析。

1.2.5 表達(dá)條件優(yōu)化 采用控制變量法，分別在不同溫度、時間、異丙基---硫代半乳糖苷IPTG濃度條件下對重組菌株pET28a-的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。

溫度：當(dāng)（600 nm）值達(dá)到0.4~0.6，在20 ℃、37 ℃，IPTG濃度為1 mmol/L條件下誘導(dǎo)4 h后，4 ℃低溫離心收集15 mL菌液，并用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗并懸浮菌液，置于冰上超聲破碎細(xì)菌，超聲破碎程序設(shè)置為：功率300 W，超聲開時間4 s，超聲關(guān)時間8 s，超聲破碎約 20 min至菌液澄清透亮?xí)r即停止。4 ℃低溫離心后分裝上清和沉淀，用8 mol/L的尿素在4 ℃條件下溶解沉淀12 h，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色并用Gel-pro Analyzer分析結(jié)果。。

時間：其他處理條件不變情況下，分別在誘導(dǎo)0、2、4、6、8和12 h時收集菌液，水煮法破碎蛋白后，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色并用Gel-pro Analyzer分析結(jié)果。

IPTG誘導(dǎo)濃度：其他處理條件不變情況下，IPTG誘導(dǎo)劑終濃度梯度設(shè)置為0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L 進(jìn)行誘導(dǎo)，水煮法破碎蛋白后，離心取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍(lán)染色并用Gel-pro Analyzer分析結(jié)果。

1.2.6 Western blot分析 在最佳表達(dá)條件下誘導(dǎo)處理重組菌株，取上清進(jìn)行His標(biāo)簽純化融合蛋白，SDS-PAGE電泳后以低溫、200 mA、150 min條件轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯PVDF膜，用塑料制的鑷子取出PVDF膜浸泡在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的封閉液中，浸泡條件為4 ℃、12 h，TTBS溶液清洗4次（10 min/次，后面步驟同）加鼠抗His-Tag單克隆抗體（體積比1∶1000稀釋）室溫?fù)u晃孵育2 h，TTBS清洗加HRP-Tag山羊抗鼠IgG室溫?fù)u晃孵育2 h，TTBS清洗后使用BAD顯色液在避光條件下顯色5 min，ddH2O終止反應(yīng)并拍照觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PspF基因擴(kuò)增及生物信息學(xué)分析

PCR擴(kuò)增獲得特異條帶（圖1），條帶大小與預(yù)測的開放閱讀框大小一致。對該片段測序結(jié)果進(jìn)行序列比對分析，發(fā)現(xiàn)其與其它弧菌的相似性較高，其中與歐文氏弧菌（）同源性高達(dá)96.13%，表明克隆得到的基因為基因。

M：DL2000 DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)；1：PspF基因克隆產(chǎn)物

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)哈維氏弧菌基因開放閱讀框ORF為981 bp，共編碼326個氨基酸，編碼的PspF蛋白理論分子質(zhì)量為38.04 ku，理論等電點5.27，不穩(wěn)定系數(shù)41.97，脂肪系數(shù)95.86，總平均親水性-0.382，表明該蛋白整體表現(xiàn)為親水性。該蛋白N端無明顯的信號肽切割位點，氨基酸序列含有2個蛋白激酶C磷酸化位點，7個酪蛋白激酶II 磷酸化位點，2個酪氨酸激酶磷酸化位，3個N端?；稽c，3個微體C末端靶信號位點（第57 ~ 59位氨基酸），1個SIGMA-54相互作用結(jié)構(gòu)域B特征ATP結(jié)合區(qū)和Sigma-54交互域C端標(biāo)記部件，具體位置如圖2所示。

酪蛋白激酶 II 磷酸化位點為下劃線標(biāo)記，蛋白激酶 C磷酸化位點為陰影標(biāo)志，酪氨酸激酶磷酸化位點為下標(biāo)波浪線，N端?；稽c為方框標(biāo)志，加粗代表微體C-末端靶信號位，首端ATG為啟動子，尾端* TAA為終止子

將PspF氨基酸序列分別使用SOPMA和SWISS-MODEL分析其二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果表明PspF蛋白中α-螺旋占45.24%，無規(guī)卷曲所占比38.99%，延伸鏈占比10.42%，β-轉(zhuǎn)角占比5.36%（圖3、4）。

藍(lán)色：α-螺旋；綠色：β-折疊；紫色：無規(guī)則卷曲；紅色：延伸鏈

圖4 PspF蛋白預(yù)測三級結(jié)構(gòu)

2.2 重組表達(dá)載體pET28a-PspF的誘導(dǎo)表達(dá)

將基因與pET-28a連接后轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21（DE），測序后比對序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的pET28a-沒有發(fā)生移碼，表明表達(dá)載體pET28a-成功構(gòu)建。用1 mmol/L IPTG 37 ℃誘導(dǎo)4 h后提取菌體蛋白，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果表明，未誘導(dǎo)的質(zhì)粒pET28a和pET28a-誘導(dǎo)前后沒有出現(xiàn)預(yù)期的表達(dá)蛋白條段，而用IPTG誘導(dǎo)的重組載體pET28a-表達(dá)得到一條約38 ku的蛋白條帶（圖5），證明基因在表達(dá)載體中成功表達(dá)。

M：100 ku蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)；1、2：空載pET28a誘導(dǎo)前、后的全菌蛋白；3、4：pET28a-PspF重組質(zhì)粒誘導(dǎo)前后的全菌蛋白

2.3 pET28a-PspF表達(dá)條件的優(yōu)化

2.3.1 溫度對重組蛋白表達(dá)的影響 溫度優(yōu)化結(jié)果表明表達(dá)載體pET28a-在20 ℃和 37 ℃條件下上清和包涵體中均有表達(dá)，且包涵體的表達(dá)均高于上清，在37 ℃條件下上清和包涵體蛋白表達(dá)量略高于20℃。

M：100 ku蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)的全菌蛋白；2、3：溫度20 ℃誘導(dǎo)的可溶性蛋白和包涵體蛋白；4、5：溫度37 ℃下誘導(dǎo)的可溶性和包涵體蛋白

2.3.2 IPTG誘導(dǎo)時間對重組蛋白表達(dá)的影響 優(yōu)化誘導(dǎo)時間結(jié)果表明，融合蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時間先增加后穩(wěn)定，6 h時表達(dá)量達(dá)到最大后表達(dá)量不再升高，故選誘導(dǎo)時間為6 h。

M：100 ku蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)的全菌蛋白；2―8：誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10、12 h后融合蛋白的表達(dá)

2.3.3 IPTG誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)濃度對重組蛋白表達(dá)的影響 PspF重組蛋白IPTG誘導(dǎo)濃度優(yōu)化結(jié)果（圖8）表明，未誘導(dǎo)的全菌蛋白（泳道1）沒有發(fā)現(xiàn)融合蛋白的表達(dá)條帶，0.2~1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后均有目的蛋白條出現(xiàn)，且0.2 mmol/L時有較高的蛋白表達(dá)量，故最佳誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L IPTG。

M：100 ku蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1：未誘導(dǎo)全菌蛋白；2―6：IPTG誘導(dǎo)濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L

綜合上述結(jié)果，pET28a-表達(dá)的最佳條件為37 ℃下IPTG濃度為0.2 mmol/L時誘導(dǎo)6 h。

2.4 Western blot分析

在37 ℃，0.2 mmol/L IPTG濃度的條件下對重組菌株和誘導(dǎo)6 h，將細(xì)胞破碎后取上清進(jìn)行純化，Western blot結(jié)果如圖9，純化后誘導(dǎo)的重組菌株全菌蛋白出現(xiàn)單一目的條帶，且大小符合預(yù)測值，而未誘導(dǎo)重組菌株無條帶出現(xiàn)，說明而未誘導(dǎo)重組菌株無條帶出現(xiàn)，說明表達(dá)蛋白與His-Tag單克隆抗體結(jié)合，PspF蛋白表達(dá)成功。

M：蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)；1：純化后的上清蛋白；2：未誘導(dǎo)的全菌蛋白

3 討論

細(xì)菌通過監(jiān)測自身的內(nèi)部和外部環(huán)境，輔助以基因調(diào)控而大量繁殖。細(xì)胞內(nèi)外部環(huán)境的唯一障礙是細(xì)胞膜和周質(zhì)空間，其決定了細(xì)胞形態(tài)、能量產(chǎn)生、提供保護(hù)、同時保持對營養(yǎng)物質(zhì)的滲透性，是許多其他重要細(xì)胞過程的場所[18-20]。在細(xì)菌侵入宿主體內(nèi)后，面臨溫度、滲透壓和酸堿度的變化，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞包膜蛋白錯配和誤導(dǎo)，改變膜的性質(zhì)，甚至破壞膜的滲透屏障。宿主會分泌膽汁鹽、其他表面活性劑和抗菌肽等物質(zhì)攻擊細(xì)菌的細(xì)胞包膜。為了防止對細(xì)胞包膜的損傷，細(xì)菌有一種稱為胞質(zhì)外應(yīng)激反應(yīng)（ESR）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，用來監(jiān)測膜室的完整性。ESR反應(yīng)的研究大多為革蘭陰性細(xì)菌[19-20]，一旦啟動了ESR，細(xì)菌體內(nèi)蛋白質(zhì)就能恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能[21]。革蘭陰性菌具有許多特征性的ESR，包括σe、Cpx、Bae、Rcs和噬菌體休克蛋白反應(yīng)（Psp）。Psp系統(tǒng)由操縱子和基因組成，在弧菌對抗宿主的免疫反應(yīng)攻擊及適應(yīng)宿主體內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮重要的作用。一般情況下，PspA與PspF蛋白相互結(jié)合形成抑制復(fù)合物，Psp系統(tǒng)處于沉默狀態(tài)，當(dāng)膜破裂發(fā)生時，PspA重新定位到細(xì)胞質(zhì)膜，與PspBC復(fù)合。也可能通過直接的膜接觸，PspF誘導(dǎo)PspA表達(dá)，由PspB和PspC感知，然后PspA釋放PspF，PspABC轉(zhuǎn)錄發(fā)生，產(chǎn)生保護(hù)反應(yīng)[9-10, 21-22]。Psp反應(yīng)最初是從F1絲狀噬菌體感染大腸桿菌時被發(fā)現(xiàn)[10]，隨后這種蛋白命名被為噬菌體休克蛋白A（PspA），并確定其產(chǎn)生是由噬菌體基因產(chǎn)物PIV誘導(dǎo)的[22]。隨著研究的深入，這種反應(yīng)不僅限于噬菌體感染，許多其他應(yīng)激源，如乙醇、熱、滲透性休克和固定相生長也是誘導(dǎo)物[22-25]。

本研究通過克隆哈維氏弧菌基因全長序列，該基因編碼的PspF氨基酸序列與其它弧菌的PspF相似性較高，其中與歐文氏弧菌（）同源性高達(dá)96.13%，三級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示PspF蛋白和其他弧菌的PspF蛋白構(gòu)型相似，因此推測哈維氏弧菌PspF蛋白具有抗弧菌共同抗原的潛力，但需要進(jìn)一步進(jìn)行原核表達(dá)、免疫原性和免疫保護(hù)性的驗證。本研究對原核表達(dá)進(jìn)行條件優(yōu)化，實驗結(jié)果表明，重組蛋白的表達(dá)和誘導(dǎo)條件有關(guān)，且包涵體表達(dá)的量比較大，其原因可能是新PspF多肽濃度較高，未及時在胞內(nèi)進(jìn)行折疊導(dǎo)致非結(jié)晶、無定形的蛋白質(zhì)聚集形成包涵體[26]，表達(dá)量在低濃度的IPTG誘導(dǎo)下即可獲得較高表達(dá)，在誘導(dǎo)時間方面，表達(dá)量隨時間先上升后穩(wěn)定，其可能因胞內(nèi)某種酶的活性受到限制[27]。Western-blotting表明PspF 融合表達(dá)的蛋白與標(biāo)簽蛋白His單克隆抗體相互結(jié)合，說明其成功表達(dá)。

目前，弧菌是海水經(jīng)濟(jì)動物的常見致病菌之一，其對種類多、繁殖快，嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。對于弧菌的治療主要采用抗生素的手段，但在長期大量使用抗生素會引發(fā)一系列問題，如耐藥菌株的產(chǎn)生[28]，破壞養(yǎng)殖微生態(tài)平衡[29]，殘留魚體的藥物會影響食用魚的安全等，因此，尋找代替途徑顯得尤為重要，而其中之一就是制備針對弧菌病的疫苗。

4 結(jié)論

本實驗克隆了哈維氏弧菌基因，得到1 179 bp堿基序列，與pET-28a（+）連接后，轉(zhuǎn)化入BL21（DE3）中構(gòu)建了重組菌株。確定最優(yōu)表達(dá)條件為37 ℃下，0.2 mmol/L 的 IPTG誘導(dǎo)6 h，表達(dá)蛋白為38 ku，通過生物信息分析后，其蛋白的同源性高，具有作為抗弧菌病疫苗的潛力。

[1] AUSTIN B, ZHANG X.: a significant pathogen of marine vertebrates and invertebrates[J]. Letters in Applied Microbiology, 2010, 43(2): 119-124.

[2] 李洋, 李強(qiáng), 張顯昱. 哈維弧菌及其主要致病因子的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2014, 16(4): 159-166.

[3] ALVAREZ, AUSTIN, ALVAREZ, et al.: a pathogen of penaeid shrimps and fish in Venezuela[J]. Journal of Fish Diseases, 2010, 21(4): 313-316.

[4] HUANG H H, LIU X L, XIANG J H, et al. Selection of-resistantvia a three-round challenge selection with a pathogenic strain of[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 35(2): 328-333.

[5] TALPUR, DAD A, IKHWANUDD.(neem) leaf dietary effects on the immunity response and disease resistance of Asian seabass,challenged; with[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2013, 34(1): 254-264.

[6] 吳立婷, 廖金軒, 龐茂達(dá), 等. 大黃魚中哈維氏弧菌毒力及耐藥特性分析[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2019, 10(8): 2111-2119.

[7] 李營, 王波, 張培玉, 等. 哈維氏弧菌引起的條紋海馬表皮潰瘍綜合征的研究[J].水產(chǎn)學(xué)報, 2019, 43(5): 1-17.

[8] MODEL P, JOVANOVIC G, DWORKIN J. Thephage shock protein operon[J]. Molecular Microbiology, 1997, 24(2): 255-261.

[9] DARWIN A. The phage-shock-protein response[J]. Molecular Microbiology, 2010, 57(3): 621-628.

[10] JOVANOVIC G, LLOYD L J, STUMPF M P, et al. Induction and function of the phage shock protein extracytoplasmic stress response in.[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(30): 21147-21161.

[11] DEANGELIS C M, NAG D, WITHEY J H, et al. Characterization of thephage shock protein response[J]. Journal of Bacteriology, 2019, 201(14): 1-46

[12] WEINER L, BRLSSETTE J L, RAMANL N, et al. Analysis of the proteins and cis-acting elements regulating the stress-induced phage shock protein operon[J]. Nucleic Acids Research, 1995, 23(11): 2030-2036

[13] JOVANOVIC G, DWORKIN J, MODEL P. Autogenous control of, a constitutively active enhancer-binding protein of[J]. Journal of Bacteriology, 1997, 179(16): 5232-5237.

[14] JOVANOVIC G, MODEL P. PspF and IHF bind co-operatively in thepromoter-regulatory region of[J]. Molecular Microbiology, 2010, 25(3): 473-481.

[15] DWORKIN J, JOVANOVIC G, Model P. Role of upstream activation sequences and integration host factor in transcriptional activation by the constitutively active prokaryotic enhancer-binding protein[J]. Journal of Molecular Biology, 1997, 273(2): 377-388.

[16] LLOYD L J, JONES S E, JOVANOVIC G, et al. Identification of a new member of the phage shock protein response in, the phage shock protein G () [J]. Journal of Biological Chemistry, 2004, 279(53): 55707-55714.

[17] SILHAVY T J, KAHNE D, WALKER S. The bacterial cell envelope[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 2010, 2(5):1-17

[18] ROWLEY G, SPECTOR M, KORMANEC J, et al. Pushing the envelope: extracytoplasmic stress responses in bacterial pathogens.[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(5): 383-394.

[19] 尹清干, 程俊茗, 劉騰飛, 等. 環(huán)境因子對鰻弧菌生物膜形成的影響[J]. 微生物學(xué)通報, 2018, 45(1): 138-145.

[20] 吳同壘, 王洪彬, 張志強(qiáng), 等. 幾個理化因素對哈維氏弧菌生物被膜形成的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志, 2019, 32(1): 35-39.

[21] YAMAGUCHI S, REID D A, ROTHENBERG E, et al. Changes in Psp protein binding partners, localization and behavior upon activation of thephage shock protein response[J]. Molecular Microbiology, 2013, 87(3): 656-671.

[22] ROWLEY G, SPECTOR M, KORMANEC J, et al. Pushing the envelope: extracytoplasmic stress responses in bacterial pathogens[J]. Nature Reviews Microbiology, 2006, 4(5): 383-394.

[23] BRISSETTE J L, RUSSEL M, WEINER L, et al. Phage shock protein, a stress protein of[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990, 87(3): 862-866.

[24] WEINER L, MODEL P. Role of anstress-response operon in stationary-phase survival[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1994, 91(6): 2191-2195.

[25] DARWIN A. The phage-shock-protein response[J]. Molecular Microbiology, 2010, 57(3): 621-628.

[26] 馮小黎. 重組包涵體蛋白質(zhì)的折疊復(fù)性[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2001, 28(4): 482-485.

[27] PATNAIK P R . Investigation of induction effect on the steady state performance of a continuous fermentation for recombinant β-ga1actosidase[J]. Process Biochemistry, 2001, 36(11): 1069-1074.

[28] 海水養(yǎng)殖源弧菌耐藥性調(diào)查及基因在弧菌中的流行情況研究[D]. 上海：上海海洋大學(xué), 2016.

[29] 黨宏月, 宋林生, 張志南. 海水養(yǎng)殖環(huán)境細(xì)菌耐藥性的危害[J]. 海洋科學(xué)集刊, 2006, 47(1): 29-40.

Cloning and Prokaryotic Expression ofGene from

MA Shao-hong, HUANG Yu-chong, JIAN Ji-chang, CAI Shuang-hu

（,//,524088,）

【】Thegene ofZJ0603 was cloned and expressed in prokaryotic, and the expression conditions were optimized. 【】Thegene instrain ZJ0603 was cloned, and its physical and chemical properties, signal peptide, subcellular localization, secondary structure and tertiary structure were analyzed. The expression vector pET28a and the PCR product of the amplified FspF gene were digested withHI andI. The pET28a-expression construct was produced after ligation of the digested vector and insert with T4 DNA ligase. The recombinant plasmid was transformed intoBL21(DE3), and the expression conditions of the recombinant strain were optimized and identified by Western Blot. 【】The open reading frame ofgene was 1179 bp in length, encoding 336 amino acids, the relative molecular weight and the theoretical isoelectric point was 38.04 ku and 5.27 respectively. The instability coefficient of the deduced protein were 41.97, and the total average hydrophilicity was -0.382. The optimal induction conditions for the expression of pET28a-were adding 0.2 mmol/L IPTG at 37 ℃ for 6 h, and the expressed protein was 38 ku in size. Western Blot results showed thatrecombinant protein was successfully obtained. The protein has high homology and potential as an anti-Vibrio vaccine.

;gene; prokaryotic expression; expression optimization

S941.4；Q786

A

1673-9159（2019）05-0001-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.001

2019-05-10

廣東省科技計劃（2016A020209010）；廣東省自然科學(xué)基金（2017A0303030975）

馬少鴻（1994－），男，碩士研究生，研究方向為水生動物病害防控。E-mail：937025291@qq.com

蔡雙虎（1979—），男，教授，研究方向為水生動物病害防控研究。E-mail：cshcai@163.com

馬少鴻，黃郁蔥，簡紀(jì)常，等. 哈維氏弧菌基因的克隆及原核表達(dá)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報，2019，39（5）：1-7.

（責(zé)任編輯：劉朏）