宣偉東，成 熙，葉曙娜，徐德東

(海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院藥學部，上海 200081)

百蕊草ThesiumchinensisTurcz，為檀香科百蕊草屬多年生寄生草本，別名細須草、一棵松、青龍草等，常附著在其他活體植物根上生長，在我國分布較廣，主要產(chǎn)地為安徽、浙江和湖北等省。百蕊草性寒，味辛、澀，歸肺、腎二經(jīng)，有清熱解毒、補腎固精之功效，現(xiàn)代藥理研究表明，百蕊草具有良好的抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、抗菌等作用[1-2]。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，百蕊草水提取物對腎病綜合征大鼠和IgA腎病大鼠均有良好的治療效果[3-4]，其水提物經(jīng)AB-8大孔樹脂吸附后，中等極性的洗出物是其抗炎活性部位[5]。進一步的化學成分分離純化研究表明，以山奈酚為母核的黃酮苷類化合物是活性部位的主要化學成分[6]。其中，含量較高的3個黃酮苷類化合物分別是：山奈酚-3-O-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(百蕊草素Ⅰ)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(紫云英苷)、山奈酚-3-O-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-[6-O-乙酰基]-β-D-吡喃葡萄糖苷(6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ)。筆者采用HPLC法，以外標法同時測定百蕊草全草中上述3個黃酮苷類化合物的含量，為百蕊草及其制劑的研究提供一種簡便、快速的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

LC-10AT色譜泵、SPD-10A紫外檢測儀(日本島津公司)，N2000色譜工作站(浙江大學智能信息工程研究所)，AB104-N電子分析天平(梅特勒-托利多)。DIKMA C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。對照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ均由本課題組從百蕊草水提取物中等極性部位分離純化得到，HPLC純度測定含量>98.5%[6]。3批百蕊草產(chǎn)地分別為：湖北荊州(安徽亳州中藥材市場,批號：20150510)、安徽池州(安徽亳州中藥材市場,批號：20150518)、河南泌陽(金滿農(nóng)場，批號：20150915)，均由海軍軍醫(yī)大學藥學院中藥鑒定學教研室孫蓮娜副教授鑒定為檀香科百蕊草屬百蕊草ThesiumchinensisTurcz的干燥全草。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為注射用水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ對照品，經(jīng)105 ℃減壓干燥至恒重。分別精密稱定上述對照品各20、4、8 mg，分別置于100 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取上述3種對照品溶液各10 ml，置于同一容量瓶中，混勻，即得對照品混合溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取干燥百蕊草全草藥材，剪成1～2 cm小段。

取上述藥材10 g，放入圓底燒瓶中，加入50%乙醇適量，水浴加熱回流提取2次，每次1 h。合并提取液，減壓回收至無醇味。濃縮液轉(zhuǎn)移至100 ml分液漏斗，用20 ml水混懸，用石油醚(10 ml)萃取2次。水層減壓回收成浸膏，加50%乙醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至100 ml量瓶中，再用50%乙醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液適量，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗

色譜柱:DIKMA C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-水(21∶79,V/V)，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH為4.61；流速：1.0 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：346 nm。對照品混合溶液和供試品溶液各進樣20 μl，分別記錄色譜圖，各組分理論塔板數(shù)均>3 000，分離度>1.5，色譜圖見圖1。

2.4 線性關系考察

以濃度(X，μg/ml)為橫坐標，面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表2。

圖 1 對照品及供試品溶液的HPLC圖 A.混合對照品溶液；B.供試品溶液 1.百蕊草素Ⅰ；2.紫云英苷；3.6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ

序號百蕊草素Ⅰμg/mlX-紫云英苷紫云英苷μg/mlX-6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰμg/mlX-1200135131240408658.380346103.52100682344.520202105.940171401.2350346551.610102179.62087646.4425172325.45.052171.81045186.6512.5903882.526366.45.023100.4

表2 各對照品線性關系考察結(jié)果

2.5 精密度試驗

取線性關系考察項中序號3對照品混合溶液(百蕊草素Ⅰ:50 μg/ml、紫云英苷:10 μg/ml、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ:20 μg/ml)，進樣20 μl，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。對照品百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為366 795.9、971 50.82、746 25.32，RSD(n=6)分別為1.08%、1.20%、1.77%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取同一份供試品溶液Ⅰ(批號：20150510)，分別于0、2、4、8、12、24 h按上述色譜條件進樣20 μl，記錄色譜圖和各成分峰面積。供試品中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為408 302.5、107 108.6、904 45.45，RSD(n=6)分別為0.85%、1.32%、2.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復性試驗

取同一批次百蕊草藥材6份(批號：20150510)，每份各約10.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，各進樣20 μl，分別記錄色譜圖和各成分峰面積。各供試品中百蕊草素Ⅰ、 紫云英苷、 6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的平均峰面積分別為335 104.2、110 128、819 38.33，RSD(n=6)分別為2.43%、2.22%、1.72%，表明本方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

依據(jù)重復性考察結(jié)果，按外標法計算10.0 g百蕊草中(批號：20150510)百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的含量分別為：45.7、1.1、2.2 mg。取上述百蕊草藥材6份，每份約5.0 g，分別置于圓底燒瓶中，每份中均加入干燥的對照品百蕊草素Ⅰ(22.9 mg)、紫云英苷(0.55 mg)和6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ(1.1 mg)，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液并按上述色譜條件進樣20 μl進行測定，記錄峰面積并計算各成分平均回收率(n= 6)。結(jié)果見表3。

2.9 樣品含量測定

取3批百蕊草藥材(批號：20150510、20150518、20150925)，按“2.2”項下方法制備供試品溶液。供試品溶液和對照品混合溶液各進樣20 μl測定，記錄峰面積。采用外標法分別計算3批百蕊草藥材中百蕊草素Ⅰ、紫云英苷、6′-乙酰氧基百蕊草素Ⅰ的含量。結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗測定結(jié)果(n=6)

表4 百蕊草中3種成分含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

文獻報道的百蕊草藥材以及上市制劑“百瑞含片”的質(zhì)量標準中[7-8]，多以山奈酚為測定指標。因山奈酚在百蕊草中含量極低，故采用酸水解法提取藥材后制備供試品溶液，以提高山奈酚的含量。經(jīng)酸水解之后制備的供試液中，山奈酚的含量已非藥材天然含有的水平，不能真實反映藥材及制劑中真實的含量。且酸水解為化學反應，可帶來不可預知的副反應及其他產(chǎn)物，水解時的pH值、時間和溫度等因素均會導致水解程度不同，影響含量的準確性。有報道提示，選用50%乙醇溶液回流提取2次，每次1 h，紫云英苷的提取率最高[7]。本實驗測定的3個黃酮苷類化合物為紫云英苷及其衍生物，結(jié)構(gòu)中均含有糖分子，在含水溶劑中溶解度較大，不溶于低極性的有機溶劑。因此，在供試品溶液制備時，選用50%乙醇溶液提取2次，并用石油醚萃取提取液，去除極性較小的成分，從而排除脂溶性成分對液相色譜的干擾。

通過對混合對照品溶液的紫外掃描，分別在265、346、378 nm處出現(xiàn)山奈酚的特征吸收峰。由于265 nm處多數(shù)成分均有吸收，專屬性不強，對基線干擾大，而368 nm的吸光度較小，故采用346 nm作為檢測波長，可以獲得分離度較好的HPLC圖譜?；谟形墨I采用一測多評法測定百蕊草中山奈酚、百蕊草素Ⅰ及百蕊草素Ⅱ的含量，采用相對校正因子計算和外標法測定3個成分的含量無顯著差異[9]，故本實驗采用外標法直接測定含量。

在百蕊草活性成分分離純化的基礎上，以3個黃酮苷化合物為對照，采用HPLC法，對湖北、安徽、河南產(chǎn)地的3批全草進行了活性成分的含量測定，首次建立了一次同時測定百蕊草中3個黃酮苷類組分的方法，可為百蕊草及其制劑的質(zhì)量控制提供一種新的、簡便、快速的分析手段。