蔡小輝，曾棋平，楊麗娜，曹毅祥，陳錦珊

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九○九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建 漳州 363000)

鐮形棘豆OxytropisfalcataBunge，系豆科棘豆屬多年生無莖草本植物。據(jù)《晶珠本草》記載，鐮形棘豆以根及根莖或全草入藥，被譽(yù)為“草藥之王”，是我國青藏高原常用的民間草藥之一[1]。研究表明鐮形棘豆主要藥理成分有黃酮類、生物堿類、甾體等，其中黃酮類具有鎮(zhèn)痛抗炎、抗氧化、抑菌等生物活性，在抗腫瘤、抗2型糖尿病及防紫外線曬傷等領(lǐng)域已有較多的研究[2-4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆總黃酮(total flavonoids fromOxytropisfalcataBunge，TFOFB)干預(yù)大鼠深Ⅱ度燒傷具有良好效果[5-6]。而TFOFB的指標(biāo)性成分之一——2′，4′-二羥基查爾酮也具有抗炎、鎮(zhèn)痛、止血、抗腫瘤、抗菌等多種作用。因此，TFOFB具有良好的開發(fā)前景，但其與體內(nèi)吸收、分布、代謝密切相關(guān)的溶解度(S)、表觀油/水分配系數(shù)(LogP)、體外透皮性質(zhì)等重要理化參數(shù)尚未見文獻(xiàn)報道。本研究以TFOFB含量為指標(biāo)，考察TFOFB的溶解度、油水分配系數(shù)等理化常數(shù)，其中包括2′，4′-二羥基查爾酮的溶解度、油水分配系數(shù)，并研究TFOFB體外經(jīng)皮滲透性能，為下一步經(jīng)皮給藥劑型設(shè)計和制備提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AUW120D電子分析天平(精確至0.01 mg，日本島津公司)；UV-2550紫外可見光分光光度計(日本島津公司)；LD5-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；SHZ-B水浴恒溫振蕩器(常州科邁實驗儀器有限公司)；DLF30連續(xù)性粉碎機(jī)(溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司)；PHS-3C型pH計(杭州雷磁分析儀器廠)；TP-3A型智能藥物透皮擴(kuò)散實驗儀(鞏義市科瑞儀器有限公司)。

1.2 試藥

鐮形棘豆(購自青海西寧，經(jīng)聯(lián)勤保障部隊909醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院鄭紹忠副主任藥師鑒定為豆科棘豆屬植物鐮形棘豆)；蘆丁對照品(純度：92.6%，中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-200707)，2′,4′-二羥基查爾酮對照品(純度：99.5%，湖北巨勝科技有限公司，批號：20171121)，甲醇、乙醇、正丁醇、正辛醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯化鋁、醋酸鈉、硫化鈉(分析純)，生理氯化鈉溶液為滅菌制劑(科室自制)，水為純化水(科室自制)。

1.3 實驗動物

清潔級Wistar大鼠，雄性，體重(225±25)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 TFOFB含量測定方法學(xué)的建立[7]

2.1.1對照品溶液的制備

取干燥至恒重的蘆丁對照品約10 mg，精密稱定，置50 ml量瓶中。加60 %乙醇適量，置 80 ℃水浴中加熱，使溶解，放冷，加 60% 乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.2 mg/ml的對照品溶液，備用。

2.1.2線性關(guān)系考察

精密量取“2.1.1”項下不同體積的對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 ml分別置入6支25 ml量瓶中，各加0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 ml與1 mol/L醋酸鈉溶液5 ml，甲醇定容至刻度，搖勻，放置5 min，同時以相應(yīng)試劑為空白，在273 nm波長處測定吸光度。以濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)，吸光度值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=0.035X-0.127(r=0.999 9)。結(jié)果表明，蘆丁對照品溶液在8.0～48.0 μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3TFOFB含有量測定

精密移取TFOFB純化液1.0 ml置25 ml量瓶中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法進(jìn)行顯色，即加入0.1 mol/L三氯化鋁溶液3 ml及1 mol/L醋酸鈉溶液5 ml，加甲醇定容至刻度，搖勻，放置5 min，以相應(yīng)試劑為空白，在273 nm 波長處測定吸光度。

2.1.4精密度試驗

精密量取對照品溶液3.0 ml，按照“2.1.2”項下方法顯色，連續(xù)測定6次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TFOFB含量，計算RSD (n=6)，結(jié)果RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.1.5穩(wěn)定性試驗

精密量取待測溶液1.0 ml置25 ml量瓶中，依“2.1.3”項下方法顯色，在120 min內(nèi)，每隔20 min測定一次吸光度，計算RSD。結(jié)果RSD為1.21%，表明TFOFB純化液在120 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.6重復(fù)性試驗

稱取6份TFOFB上樣液，在優(yōu)化工藝條件下上樣和洗脫，并按“2.1.3”項下方法操作，測得TFOFB含有量RSD為1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7加樣回收率試驗

將蘆丁對照品溶液加到最優(yōu)提取工藝條件下得到的樣品溶液(TFOFB含量為23.21 mg/g) 中，然后按“2.1.3”項下方法顯色，測定溶液吸光度，測得平均回收率為100.70%，RSD 為1.24% (n=6)。

2.2 HPLC測定2′,4′-二羥基查爾酮

2.2.1對照品溶液的制備

取2′,4′-二羥基查爾酮對照品適量，精密稱定，置于50 ml棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成164.0 μg/ml的對照品溶液。搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2.2供試品溶液的制備

精密吸取TFOFB純化液1 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇適量，超聲5 min，搖勻并以甲醇稀釋至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2.3色譜條件

采用Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.2%甲酸(50∶50)為流動相，流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量10 μl；柱溫30℃，檢測波長365 nm。

2.2.4線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 ml至10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積，以峰面積對質(zhì)量濃度(μg/ml)進(jìn)行線性回歸，得2′,4′-二羥基查爾酮的回歸方程Y=84.108X-20.184，r=0.999 9，表明2′,4′-二羥基查爾酮在8.2～164.0 μg/ml范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗

分別取低、中、高質(zhì)量濃度的2′,4′-二羥基查爾酮對照品溶液(15.8、126.4、252.8 μg/ml)，用HPLC法在365 nm波長處連續(xù)測定6次峰面積，計算日內(nèi)精密度，分別在5 d內(nèi)每天用HPLC測定峰面積，計算日間精密度。結(jié)果2′,4′-二羥基查爾酮低、中、高3個質(zhì)量濃度的日內(nèi)精密度分別為1.58%、0.86%、0.75%；日間精密度分別為1.98%、0.95%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件在0、1、2、4、6、12 h進(jìn)樣測定峰面積，共測定6次，分別測定2′,4′-二羥基查爾酮峰面積值，結(jié)果2′,4′-二羥基查爾酮峰面積值RSD為1.08%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗

按供試品溶液的制備方法制備6份TFOFB-CPL溶液，每份測定3次，記錄色譜峰面積，計算得2′,4′-二羥基查爾酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.78%。

2.2.8回收率試驗

分別精密吸取供試品溶液1 ml共9份，置于10 ml量瓶中，分別加入3份1 ml低、中、高質(zhì)量濃度的(32.5、75.0、150 μg/ml)對照品溶液，混勻，再加入甲醇稀釋至刻度，超聲5 min，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，用HPLC測定峰面積并計算加樣回收率。結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的2′,4′-二羥基查爾酮的回收率分別為102.35%、101.08%、100.05%，RSD分別為0.78%、1.25%、1.32%(n=3)。

2.3 TFOFB的提取及純化[7-8]

精密稱取適量鐮形棘豆粗粉，置圓底燒瓶中，加入20倍量66%乙醇回流提取2次，每次84 min，過濾，合并濾液，作為上樣液。以D-101大孔樹脂上柱，上樣濃度為275 mg/g，洗脫劑為80%乙醇，洗脫液減壓濃縮真空干燥，得純度為69.08%的總黃酮粉末。

2.4 TFOFB溶解度的測定

精密稱定TFOFB粉末或2′,4′-二羥基查爾酮0.1 g，分別加入水、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚和不同pH的磷酸鹽緩沖液各10 ml制成過飽和溶液，于(37±1)℃、100 r/min恒溫水浴中機(jī)械振蕩，24 h后取樣，分別進(jìn)行含量測定，計算TFOFB及2′,4′-二羥基查爾酮在不同溶劑中的溶解度，結(jié)果見表1。由結(jié)果可知，與純化水相比，TFOFB在甲醇、乙醇及pH 5.0～7.4的磷酸鹽緩沖液中溶解度較好；2′,4′-二羥基查爾酮難溶于水，在乙醇等有機(jī)試劑中溶解度顯著提高。

表1 TFOFB在不同溶劑中的溶解度

2.5 TFOFB表觀油水分配系數(shù)的測定

取適量水或不同pH的磷酸鹽緩沖液于錐形瓶中，加入等量的正辛醇，在振蕩器上常溫振蕩24 h，使其互相飽和，靜置分層后，分離兩相，分別保存?zhèn)溆?。取適量的TFOFB 7份及2′,4′-二羥基查爾酮1份，分別加入被正辛醇飽和的水或緩沖溶液中，靜置后于4 000 r/min離心15 min，精密吸取上清液5 ml置于錐形瓶中，再分別加入被水/緩沖溶液飽和的正辛醇5 ml，于快速混勻器上混勻10 min，靜置1 h，靜置后取下層水相溶液以及混合前的水相溶液進(jìn)行含量測定，分析TFOFB及2′,4′-二羥基查爾酮在平衡前后的質(zhì)量濃度，計算表觀油水分配系數(shù)(P)公式為：

P=(C0-C1)/C1

式中，C0和C1分別為混合前后下層水相中TFOFB的質(zhì)量濃度。結(jié)果見表2。由結(jié)果可知，當(dāng)pH值在2.5～7.4時，隨著pH值的增加，總黃酮的logP值逐漸減小。TFOFB的logP值在0.38～1.34之間。而2′,4′-二羥基查爾酮的logP值為2.50。

表2 TFOFB在不同pH緩沖液中的表觀油水分配系數(shù)(LogP)

2.6 TFOFB體外經(jīng)皮滲透性能研究[9]

2.6.1供試品的制備

取TFOFB適量，精密稱定，加60%乙醇制備濃度為10 mg/ml的供試品溶液。

2.6.2接收液的選擇

以不同溶劑作為接收液，通過考察供試品經(jīng)皮滲透后的濃度，從而選出適宜的接收液，結(jié)果見表3。

2.6.3離體皮膚的制備

取同一批次的健康大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，用6%Na2S溶液將大鼠胸腹部脫毛，斷頸處死，剪下腹部皮膚，去除皮下組織和黏液組織后洗凈，置于生理鹽水中，放置于冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.6.4經(jīng)皮滲透性實驗

將制備好的大鼠皮膚角質(zhì)層朝上固定在改良的Franz擴(kuò)散池上，保持真皮層和接受液密切接觸，并確保接收室中無氣泡，接收池(擴(kuò)散面積為3.4 cm2，容積為20 ml)中加入50%乙醇生理鹽水作為接收液，內(nèi)置一磁力攪拌棒，將接收池置于磁力攪拌器上，攪拌速率為300 r/min，水浴溫度為(37±1)℃。分別于1、2、4、6、8、12、24 h從接收池中吸取5 ml，同時補(bǔ)充等量接收液，以滿足漏槽條件。取出的接收液依法測定，計算藥物累積透過量(Qn)。透皮實驗結(jié)束后，取下皮膚，用接收液將皮膚表面殘留的供給液洗凈，剪碎，加甲醇5 ml超聲提取2次，每次30 min，取上清液進(jìn)行紫外分析測定，計算藥物的皮膚滯留量(Qs)和累積透過率(Q)，平行操作3份，以不同時間的藥物累積透過量(Qn，μg/cm2)對取樣時間(t)作曲線，并對曲線中的直線部分進(jìn)行線性回歸，求出的直線斜率即為穩(wěn)態(tài)透皮速率[JS，μg/(cm2·h)]，直線與X軸的交點為時滯(tlag，h)。結(jié)果見表4。藥物累積透過量Qn的計算公式為：

式中，A為有效擴(kuò)散面積，V為接收液總體積，ρn為第n次取樣時接收液中藥物的質(zhì)量濃度，ρi為第i次取樣時接收液中藥物的質(zhì)量濃度，Vi為取樣體積；

QS=Vρ/A；Q=(Q24·A) /M

式中，V為皮膚提取液總體積，ρ為皮膚提取液中藥物的質(zhì)量濃度，M為供給室藥液質(zhì)量。

表3 接收液的考察試驗(n=3，μg/ml)

表4 TFOFB由體外經(jīng)皮滲透參數(shù)(n=3)

3 討論

黃酮類化合物是鐮形棘豆的主要活性成分，目前已分離得到的黃酮類化合物多達(dá)20余種。TFOFB具有抗氧化、抗纖維化、抑菌等作用，還可作為藥效成分用于開發(fā)抗紫外線曬傷及抗深Ⅱ度燒傷的外用制劑[2,6]。藥物理化性質(zhì)的研究是藥物制劑設(shè)計的基本要素之一，因此，研究TFOFB的溶解度與表觀油水分配系數(shù)具有重要意義，溶解度可影響制劑的吸收和生物利用度，而表觀油水分配系數(shù)與制劑活性成分的溶解、吸收、分布、轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)。

本次研究表明，TFOFB溶液的親脂性強(qiáng)于親水性，且在弱酸及中性條件下的溶解度較好；其單體成分2′,4′-二羥基查爾酮也具有較好的親脂性。有研究報道，若化合物的logP值過低(logP<-2)則無法穿過脂質(zhì)膜，logP值過高(logP>3)則會因為脂溶性強(qiáng)而難以從細(xì)胞另一側(cè)的膜釋放出來，最適宜經(jīng)皮吸收的logP值為2.6[10]。本研究中，TFOFB的logP值在0.38～1.34之間，表明其具有一定的皮膚透過性，但透過性不高，無法實現(xiàn)最適宜經(jīng)皮吸收的目標(biāo)。而其單體成分2′,4′-二羥基查爾酮的logP值為2.24，表明透皮吸收性較好。此外，體外透皮實驗得出TFOFB累積透過率較低，且有一定的時滯，表明TFOFB經(jīng)皮滲透性能差。

綜上所述，若將TFOFB開發(fā)成經(jīng)皮給藥制劑，必須綜合考察藥效成分特點、制劑劑型及制備工藝等進(jìn)行系統(tǒng)研究。比如，可加入一定量的表面活性劑、增溶劑、透皮促進(jìn)劑或物理方法來增強(qiáng)藥物的經(jīng)皮吸收，也可考慮脂質(zhì)體、微乳、納米粒等經(jīng)皮給藥新型載體。其中，脂質(zhì)體具有類脂雙分子層結(jié)構(gòu)，可攜帶藥物滲透進(jìn)入不規(guī)則的脂質(zhì)雙分子層，促進(jìn)藥物透過皮膚，增加藥物的經(jīng)皮滲透量；微乳是一種膠體分散體系，可增加藥物溶解度，提高藥物濃度梯度，促進(jìn)角質(zhì)層脂質(zhì)雙層的流動性，并且其分散相可作為藥物儲庫；納米粒是用適宜的高分子材料制成的固態(tài)膠體分散系統(tǒng)，除了可在皮膚形成儲庫外，還可通過改變藥物在載體-皮膚中的分配系數(shù)調(diào)控藥物的透皮吸收過程?？傊?，新型載體可增加藥物溶解性，促進(jìn)藥物的透皮吸收，同時具有藥物儲庫功能，有助于活性成分透過表皮層，滯留于真皮層，進(jìn)而提高制劑的生物利用度。