鄭佳東，周培培，戚玉若，官若楚，欒璐璐，付麗娜

(黃河科技學院 醫(yī)學院，河南 鄭州 450063)

黑木耳(Auricularia auricula)又稱云耳，是藥食兩用的大型真菌[1]。黃酮是黑木耳中主要活性成分，具有抗凝血、降血脂等多種功效，在醫(yī)藥和食品領域顯示出良好的應用前景[2]。超聲波輔助提取植物中有效成分的技術已被廣泛應用，具有提取率高、提取時間短等優(yōu)點。試驗以黑木耳為研究對象，利用超聲波輔助方法提取黑木耳黃酮，設計單因素試驗，以料液比、超聲溫度、超聲功率及乙醇濃度為考察因素，通過正交試驗優(yōu)化黑木耳黃酮的提取條件，為深度開發(fā)利用黑木耳資源提供科學依據[3]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳干品(產地：黑龍江牡丹江市)，蘆丁標準品(北京化學試劑公司)，NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、乙醇等試劑購于天津市科密歐化學試劑有限公司，所有試劑均為分析純。

1.2 儀器

TU-1810紫外-可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；KQ-500DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；XFB-200型粉碎機：吉首市中誠制藥機械廠；3號藥典篩(孔徑0.36 mm，50目)、5號藥典篩(孔徑0.18 mm，80目)：浙江上虞市五四儀器篩具廠；SHZ-D(Ш)循環(huán)水式多用真空泵：邦西儀器科技(上海)有限公司；遠紅外鼓風干燥箱：天津市華北實驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑木耳的預處理

將黑木耳洗凈，晾干，于烘箱中55℃干燥至恒重，粉碎，先后過3號和5號藥典篩、裝瓶備用[4]。

1.3.2 繪制蘆丁標準曲線

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標準品25 mg，置50 mL容量瓶，加75%的乙醇定容，搖勻，得0.5 mg/mL蘆丁標準溶液，精密移取標準溶液0、1、2、3、4、5、6和7 mL分別放置于100 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，之后加4%NaOH溶液10 mL，定容，搖勻，靜置15 min，用紫外可見分光光度計510 nm處測定吸光度A[5]。以蘆丁濃度為橫坐標、吸光度A為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程：Y=0.7605X+0.0574 ，R2=0.9993，說明線性關系良好。

1.3.3 黃酮類化合物的測定

精密稱取2.0000 g干燥至恒重的黑木耳粉末，設置料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 g/mL)用(50%、60%、70%、80%、90%)乙醇溶解，定容，搖勻，于功率(50、60、70、80、90 W)、溫度(40、50、60、70、80℃)條件下超聲處理，冷卻，抽濾，將濾液轉移到50 mL容量瓶中定容，搖勻，移取10 mL分別放置于50 mL容量瓶中，然后加5%NaNO2溶液1 mL和10%Al(NO3)3溶液1 mL，靜置10 min，搖勻，加入4%NaOH溶液10 mL定容，搖勻，靜置15 min，于紫外可見分光光度計510 nm處測定吸光度A[6]。

1.3.4 黑木耳黃酮類化合物的測定

采用NaNO2-Al (NO3)3顯色法，測定提取液中黃酮類化合物的含量。

黃酮提取率%=C×V×N×100/M；其中，式中，C為提取液質量濃度(mg/mL)；V為定容體積(mL)；N 為稀釋倍數；M 為粉末質量(mg)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 最佳料液比的確定

固定溫度60℃、功率100 W、乙醇濃度80%，設置料液比分別為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g/mL)5個水平，按照1.3.3方法測定黑木耳中黃酮的提取率，結果如圖2。

圖2 料液比對黑木耳黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liqiud rate on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

由圖2得出，隨著料液比的增加黃酮提取率出現逐漸升高然后降低的趨勢?？赡苁且驗槿軇┝刻贂r，黃酮的溶出量較少，之后慢慢增加，但溶劑量過大時雜質的溶出也會增加，導致提取率降低[7]，因此將最佳料液比確定為1∶6。

2.1.2 超聲溫度的選擇

固定料液比1∶6、功率100 W、乙醇濃度80%，設置超聲溫度分別為40、50、60、70、80℃共5個水平，按照1.3.3方法測定黑木耳中黃酮的提取率，結果如圖3。

從圖3可知，隨溫度的升高黃酮提取率不斷升高，在60℃時提取率最高，之后提取率出現下降的趨勢，這可能是由于提取溫度過高時，黃酮類化合物的結構受到破壞，因此選擇60℃為提取黑木耳黃酮的最佳溫度[8]。

圖3 超聲溫度對黑木耳黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

2.1.3 超聲功率的選擇

固定料液比1∶6、溫度60℃、乙醇濃度80%，設置超聲溫度分別為50、60、70、80、90 W共5個水平，按照1.3.3方法測定黑木耳中黃酮的提取率，結果如圖4。

圖4 超聲功率對黑木耳黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

從圖4可以看出，黃酮的提取率隨著超聲功率的增加而升高，在超聲功率為80 W時提取率最高，超聲功率超過80 W時提取率明顯減少，因此將最佳超聲功率確定為80 W。

2.1.4 乙醇濃度的選擇

圖5 乙醇濃度對黑木耳黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of flavonoids from Auricularia auricular

固定料液比1∶6、溫度60℃、功率80 W，設置超聲溫度分別為50%、60%、70%、80%、90%共5個水平，按照1.3.3方法測定黑木耳中黃酮的提取率，結果如圖5。

從圖5看出，隨著乙醇濃度的增加黃酮的提取率也在不斷增加，在乙醇濃度為80%時提取率達到最高，而后出現下降的趨勢，所以選擇最佳超聲功率為80%。

2.2 正交試驗

表1 正交試驗結果表Table 1 Orthogonal experiment results and analysis table

對表1的數據進行分析，影響黃酮提取率的因素順序依次是乙醇濃度、超聲功率、溫度、料液比，其中乙醇濃度對黃酮提取率的影響最大。從表中的極差值分析出最佳提取條件為∶料液比1∶6、溫度70℃、功率70 W、乙醇濃度75%。

2.3 驗證試驗

表2 驗證試驗結果Table 2 Verification testing results

為了驗證正交試驗結果，在最佳提取條件下進行三次平行試驗，即料液比1∶6(g/mL)、超聲溫度70℃、超聲功率70 W、乙醇濃度75%(表2)，得到平均提取率為0.92%，RSD=1.081%，結果顯示離散程度小，即精密度高、結果重現性好。

3 結論

通過單因素試驗考察料液比、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度對黑木耳中黃酮提取率的影響，并設計正交試驗優(yōu)化提取工藝，最終確定超聲波輔助提取黑木耳黃酮的最佳條件為：料液比1∶6(g/mL)、超聲溫度70℃、超聲功率70 W、乙醇濃度75%，提取率為0.92%。在該提取工藝條件下黃酮提取率較高，利用超聲波輔助提取方法減少了資源消耗，節(jié)省了時間，該項研究為進一步開發(fā)黑木耳資源提供了科學依據。