施啟豐 崔成軍 王昊玨 耿建祥 蘭建云 王志蕙 蔡為民 王宏景 趙 雪

(1.無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院病理科，江蘇 無(wú)錫 214011；2.無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院皮膚科，江蘇 無(wú)錫 214011；3.無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇 無(wú)錫 214011；4.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科，江蘇 南京 210001)

宮頸癌是女性生殖道惡性腫瘤發(fā)病率第一位的惡性腫瘤，而其中宮頸鱗狀細(xì)胞癌約占60%～70%的比例[1-2]。目前的研究顯示，宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(HPV)感染密切相關(guān)[3-4]，后者是引起宮頸癌的明確致病因子[5]。因此對(duì)于宮頸細(xì)胞學(xué)檢查及宮頸乳頭瘤病毒的篩查，已經(jīng)成為宮頸癌防治的重要策略。我們應(yīng)用基因擴(kuò)增芯片技術(shù)對(duì)705份宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織進(jìn)行23種HPV分型檢測(cè)，并對(duì)23種HPV型別在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的感染特征進(jìn)行探討，為宮頸鱗狀細(xì)胞癌的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本組病例選取2006年1—6月間無(wú)錫市錫山人民醫(yī)院、南京市中醫(yī)院、徐州市中醫(yī)院、江蘇省揚(yáng)中市人民醫(yī)院、常熟市第一人民醫(yī)院、南京市六合區(qū)人民醫(yī)院、江蘇省射陽(yáng)縣人民醫(yī)院、南京市大廠醫(yī)院、鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院、鹽城市第一人民醫(yī)院、鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)人民醫(yī)院、安徽省當(dāng)涂縣人民醫(yī)院、山東省臨沂市腫瘤醫(yī)院病理科診斷的705例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的石蠟組織標(biāo)本，所有病理切片均按2014年WHO女性生殖器官腫瘤的組織學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)兩位主治以上病理醫(yī)師獨(dú)立閱片確認(rèn)。患者20～29歲7例，30～39歲63例，40～49歲258例，50～59歲204例，60～69歲104例，70～79歲56例，80～89歲12例，90歲以上1例。平均年齡(52.45±11.52)歲。

1.2儀器與試劑 HPV基因分型檢測(cè)試劑盒購(gòu)自亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司；基因擴(kuò)增儀為新加坡生產(chǎn)的Gene Amp PCR system 2400型；分子雜交儀為江蘇省興化市分析儀器廠生產(chǎn)的FYY3型；高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)生產(chǎn)的Eppendorf 5810R型；生物安全柜為江蘇省蘇州市安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BHC-1300ⅡA2型；青島海爾有限公司生產(chǎn)的-20 ℃冰箱等。顯色液于使用時(shí)用蒸餾水新鮮配制。

1.3方法 (1)石蠟組織切片：先去除每例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織周邊的石蠟，將石蠟包埋的組織切成4 μm厚的切片，3～5片即可，用專用的鑷子輕輕夾取，放入1.5 mL離心管中。切第2例石蠟組織前，用次氯酸鈉溶液擦刀片及鑷子各3次。(2)DNA的提?。簩?50 μL裂解液加入含有石蠟組織片的離心管中，充分振蕩混勻，100 ℃金屬浴加熱10 min，立即13 000 rpm離心10 min，取中間層DNA溶液待用。(3)PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系總體積27 μL，上機(jī)擴(kuò)增條件為50 ℃ 15 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s；42 ℃ 90 s；72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。(4)雜交、孵育和顯色：51 ℃雜交箱內(nèi)雜交1.5 h，室溫孵育30 min，顯色至少30 min。終止顯色，轉(zhuǎn)移至去離子水中浸泡即可觀察結(jié)果。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS13.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，分類變量資料采用χ2和μ檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，取單側(cè)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1結(jié)果判定 (1)實(shí)驗(yàn)后每張膜條在PC位點(diǎn)必須出現(xiàn)藍(lán)色顯示信號(hào)；(2)陰性質(zhì)控品除PC位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào)外其余位點(diǎn)均不出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào)；(3)陽(yáng)性質(zhì)控品除PC位點(diǎn)出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào)外，必須在相應(yīng)HPV基因型位點(diǎn)上出現(xiàn)藍(lán)色顯色信號(hào)；(4)每張膜條上除PC位點(diǎn)外有23種HPV型別(6、11、42、43、44、16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83、MM4型)的雜交顯色位點(diǎn)，除PC位點(diǎn)顯色外，肉眼可觀察23種HPV型別位點(diǎn)上呈現(xiàn)藍(lán)色小圓點(diǎn)為陽(yáng)性信號(hào)；(5)出現(xiàn)一個(gè)陽(yáng)性信號(hào)為單一型別的感染，出現(xiàn)兩個(gè)陽(yáng)性信號(hào)為雙型別的混合感染，出現(xiàn)兩個(gè)以上的陽(yáng)性信號(hào)為多型別的混合感染。

2.2HPV總感染情況 705例患者中，66例HPV病毒檢測(cè)為陰性，陰性率為9.36%(66/705)；639例23種HPV基因分型檢測(cè)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為90.64%(639/705)；其中單獨(dú)HPV型別感染527例，2種HPV感染92例，3種HPV感染15例，4種HPV感染2例，5種、6種及9種HPV感染各1例。HPV型別的分布情況見(jiàn)表1，其中HPV16、18、58、33、52、31型依次為感染陽(yáng)性率前6的病毒。

表1 639例HPV分型檢測(cè)陽(yáng)性分布表

2.3HPV型別感染情況 在本組病例中，HPV感染型別占比5%以上的型別分別為16、18及58型。HPV16單獨(dú)或合并其他HPV感染462例，占全部病例數(shù)的65.53%(462/705)，其中單一型別HPV16型感染376例，占HPV16感染數(shù)的81.39%(376/462)；HPV18病毒單獨(dú)或合并其他型別感染86例，占全部病例的12.20%(86/705)，其中HPV18病毒單一型別感染36例，占HPV18感染數(shù)的41.86%(36/86)；HPV58型單獨(dú)或合并其他HPV感染51例，占全部病例數(shù)的7.2%(51/705)，其中單獨(dú)HPV58型感染25例，占HPV58型總感染數(shù)的49.01%(25/51)。

2.4HPV型別和發(fā)病年齡相關(guān)情況 HPV陰性組發(fā)病年齡(56.22±11.19)歲與總HPV感染后發(fā)病年齡(52.67±11.50)歲相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。與HPV陰性組發(fā)病年齡相比，HPV16感染后發(fā)病組年齡為(50.18±10.31)歲，差異有顯著性(μ=4.14，P<0.001)；同樣HPV18感染組年齡為(51.19±9.62)歲， 差異有顯著性(μ=2.92，P<0.05)；HPV58型感染組年齡為(64.29±13.25)歲，差異有顯著性(μ=3.49，P<0.001)；而HPV33型、31型、52型感染組發(fā)病年齡與HPV陰性組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

在我國(guó)宮頸癌是女性發(fā)病率僅次于乳腺癌的常見(jiàn)惡性腫瘤。研究明確，宮頸癌的發(fā)生與生殖道的HPV病毒感染密切相關(guān)。HPV感染除了能夠引起機(jī)體多種形式的損傷外，病毒DNA還能夠與宮頸上皮細(xì)胞DNA進(jìn)行整合，導(dǎo)致宿主宮頸上皮細(xì)胞的異常增殖[6]，進(jìn)而發(fā)展為宮頸不典型增生、甚至癌變。

目前發(fā)現(xiàn)的HPV類型有200多種，主要分為皮膚型和生殖道黏膜型，根據(jù)致病性，HPV又可劃分為高危和低危兩類，其中低危型包括HPV6、11、42、43、44等型別，常引起外生殖器濕疣等良性病變；高危型一般包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型別。也有學(xué)者把HPV73、82歸入高危型，目前尚缺乏統(tǒng)一共識(shí)，但HPV16和18型與宮頸上皮內(nèi)高度病變、宮頸癌及其他惡性腫瘤發(fā)生有明確相關(guān)性，這一點(diǎn)已在全球得到廣泛認(rèn)同[7-8]。

有研究顯示，檢測(cè)方法的不同會(huì)影響到宮頸癌HPV病毒的檢出率，而采用本文所用的基因擴(kuò)增法，檢出率能夠達(dá)到90.64%，可以為宮頸癌的防控及疫苗的改進(jìn)提供可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。本組資料結(jié)果顯示除HPV16、18型外，HPV58型檢出率也高于5%，提示應(yīng)將HPV58列入該地區(qū)的HPV病毒檢測(cè)類型，以確保陽(yáng)性檢出率；同時(shí)在HPV病毒疫苗的研發(fā)過(guò)程中，需要充分分析不同亞型HPV病毒感染率的地區(qū)性差異，才能開(kāi)發(fā)出更適合國(guó)人的疫苗[10]。本資料中不同HPV病毒亞型和感染后發(fā)病年齡的相關(guān)性結(jié)果提示，對(duì)HPV16、18、58型病毒感染的患者需要加強(qiáng)隨訪，以便能更好地達(dá)到防治宮頸癌的效果[11]。

本資料中我們對(duì)一組江蘇及山東部分地區(qū)的婦女宮頸鱗狀細(xì)胞癌病例標(biāo)本進(jìn)行了HPV病毒檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)本組705例患者中，23種HPV基因分型檢測(cè)陽(yáng)性者為639例，陽(yáng)性率達(dá)90.64%，且以HPV16、18及58型感染為主，與國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)不同地域、不同高危型別的研究結(jié)論一致[12-13]。我國(guó)江蘇及山東部分地區(qū)HPV58型感染率顯著高于國(guó)外，可見(jiàn)WHO建議各地區(qū)建立宮頸癌組織 HPV感染的基因分型數(shù)據(jù)庫(kù)是十分重要的[14]。我們發(fā)現(xiàn)HPV31、33、52型 為僅次于前三型的高危病毒，與其他學(xué)者報(bào)道[15]的相關(guān)數(shù)據(jù)有所差異，不同的檢測(cè)方法及患者年齡、地域等因素或許是其順序不同的原因。排位靠后的三型病毒感染人數(shù)偏少且有合并感染，故我們認(rèn)為此排列順序?qū)εR床意義較小。(2)單種病毒感染更易誘發(fā)宮頸鱗狀細(xì)胞癌，而以多種病毒感染為輔，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者[16]對(duì)于浙江地區(qū)HPV感染患者宮頸鱗狀細(xì)胞癌以單病毒感染為主的研究結(jié)果一致。值得注意的是，多位國(guó)外學(xué)者[17-18]發(fā)現(xiàn)多種感染所致的腫瘤發(fā)病率明顯增高，而這一點(diǎn)在國(guó)內(nèi)的研究中并未得到證實(shí)，我們推測(cè)：特定型別的病毒搭配所致的多重感染或許可影響腫瘤發(fā)展的進(jìn)程，而也有學(xué)者[19]認(rèn)為病毒間的相互拮抗導(dǎo)致多重感染的癌病率降低，其確切原因仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。(3)感染率排前6位的HPV病毒為HPV16、18、58、33、52、31型，其中超過(guò)5%感染例數(shù)的病毒為HPV16、18、58型。(4)與病毒檢測(cè)結(jié)果為陰性的患者相比，HPV16、18型病毒感染者的發(fā)病年齡明顯高于陰性組及其他各型病毒感染組，而HPV58型為我國(guó)較為特殊的致病型別，但目前其發(fā)病年齡并未受到重視，HPV58型感染者似乎有更長(zhǎng)的腫瘤進(jìn)展期，進(jìn)一步探究其導(dǎo)致延遲發(fā)病的機(jī)制，這對(duì)于我國(guó)HPV感染及相關(guān)疾病的防治具有重要意義。