陳向東,吳曉軍，胡鐵柱，李笑慧，李 淦，侯開(kāi)心，茹振鋼

(河南科技學(xué)院 小麥中心/河南省雜交小麥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng) 453003)

小麥?zhǔn)且环N適應(yīng)性強(qiáng)、分布廣泛的世界性糧食作物，為人類提供的熱量和蛋白質(zhì)分別約占食物總熱量和總蛋白質(zhì)的21%和20%[1]。小麥條銹病是由小麥條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici)引起的世界范圍內(nèi)嚴(yán)重發(fā)生的小麥病害之一，也是我國(guó)小麥生產(chǎn)上最重要的病害，嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食生產(chǎn)，一般情況下會(huì)造成小麥減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致小麥絕產(chǎn)。

近年來(lái)，條銹菌生理小種CYR32、CYR33(水源11)逐漸發(fā)展為優(yōu)勢(shì)小種，另外，新出現(xiàn)了強(qiáng)毒性生理小種CYR34(貴農(nóng)22)，導(dǎo)致現(xiàn)有大部分小麥主栽品種喪失條銹病抗性[2]。目前，利用抗條銹病品種是防治該病最經(jīng)濟(jì)、有效、易行且對(duì)環(huán)境安全的措施。條銹病抗性育種的效率主要取決于高效、多樣化抗源的挖掘和快速、準(zhǔn)確的選擇鑒定手段。目前，正式公布的小麥抗條銹病基因有Yr1(Yellow rust 1)—Yr79，大部分表現(xiàn)出小種?；蚚3-4]。這些基因中對(duì)我國(guó)小麥條銹病菌主要流行生理小種CYR32和CYR33有抗性的主效基因?yàn)閅r5、Yr8、Yr10、Yr15、Yr17、Yr24、Yr26等，有潛在的利用價(jià)值[5-6]。

小麥1BS 染色體臂上含有豐富的抗條銹病基因，如已被定位的Yr10、Yr15、Yr24(YrCH42或Yr26)等，對(duì)我國(guó)當(dāng)前條銹病流行生理小種具有較強(qiáng)的抗性[7-9]。快速、準(zhǔn)確鑒定小麥種質(zhì)資源中這些抗條銹病基因的分布情況，對(duì)于小麥安全生產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)抗源合理布局、延緩品種抗條銹病性喪失具有重要意義。目前，研究者對(duì)國(guó)內(nèi)的小麥栽培品種或農(nóng)家品種中的Yr5、Yr9(1BL/1RS)、Yr10、Yr15、Yr18、Yr24、Yr26基因進(jìn)行了分子檢測(cè)及抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的小麥品種(系)對(duì)當(dāng)前條銹菌流行小種的抗性水平普遍較低[10-12]。李峰奇等[13]對(duì)黃淮麥區(qū)126個(gè)小麥品種(系)中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr15基因進(jìn)行分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅有11個(gè)品種(系)對(duì)CYR32和CYR33表現(xiàn)免疫或近免疫，占8.73%；董淑靜等[14]對(duì)河南省43個(gè)主推品種中的Yr5、Yr9、Yr10、Yr24、Yr26等基因進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Yr10和Yr24基因均對(duì)當(dāng)前生理小種CYR32和CYR33 具有良好的抗性，而Yr9基因已喪失抗性。董娜等[15]對(duì)外引39份小麥種質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含有Yr5、Yr10、Yr18基因的種質(zhì)分別為21、2、6份。綜上，目前的研究較少涉及對(duì)國(guó)內(nèi)和國(guó)外小麥種質(zhì)同時(shí)進(jìn)行田間條銹病抗性鑒定及分子檢測(cè)，尤其是在黃淮麥區(qū)。為此，在黃淮麥區(qū)，利用與抗條銹病基因Yr10、Yr15、Yr24共分離或緊密連鎖的STS或SSR標(biāo)記對(duì)124份國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)和4 a的抗條銹病鑒定，擴(kuò)大條銹病抗性遺傳基礎(chǔ)，以期為黃淮麥區(qū)小麥品種布局及抗條銹病品種改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試124份國(guó)內(nèi)外小麥種質(zhì)見(jiàn)表1。

1.2 小麥抗條銹病調(diào)查

所有小麥種質(zhì)均種植于新鄉(xiāng)市輝縣的種質(zhì)圃中,每份種質(zhì)播種2行,畦埂上種誘發(fā)行(石家莊8號(hào)),常規(guī)田間管理，于2011—2012年、2012—2013年、2016—2017年和2017—2018年接種條銹菌混合小種(CYR32、CYR33)。于小麥拔節(jié)期(3月中下旬),采用孢子懸液注射法進(jìn)行接種,每行接種1個(gè)分蘗。灌漿初期，調(diào)查條銹病發(fā)病情況。病級(jí)劃分采用0～4級(jí)法。0(免疫型):葉上無(wú)可見(jiàn)癥狀；0;(近免疫型):葉上產(chǎn)生小枯斑,無(wú)孢子堆；1(高抗型):夏孢子堆小,周圍有枯斑；2(中抗型):夏孢子堆小到中等大小,生在綠色組織上,周圍有枯斑；3(中感型):夏孢子堆較大,周圍組織有褪綠現(xiàn)象；4(高感型):夏孢子堆大,周圍不褪綠。

表1 國(guó)內(nèi)外124份小麥種質(zhì)的來(lái)源

續(xù)表1 國(guó)內(nèi)外124份小麥種質(zhì)的來(lái)源

1.3 基因組DNA的提取及分子標(biāo)記檢測(cè)

小麥三葉期，取小麥幼葉，采用CTAB法提取基因組DNA[16]。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果。

選用目前生產(chǎn)上抗性較好且已開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的抗條銹病基因Yr10、Yr15和Yr24進(jìn)行分子檢測(cè)。分子標(biāo)記引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列信息見(jiàn)表2。PCR擴(kuò)增于ABI Gene Amp PCR System 9700型PCR儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10 μL,包括2×TaqMaster Mix 9(購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)5 μL，10 μmol/L上、下游特異引物各1 μL，模板DNA 50～100 ng，其余用ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物于170 V下用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳約1 h，經(jīng)銀染和顯影后，利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并拍照保存。

表2 抗病基因、分子標(biāo)記及其引物序列Tab.2 Disease-resistant genes,markers and their sequences used in this research

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥種質(zhì)中抗條銹病基因Yr10的檢測(cè)分析

利用與Yr10基因共分離的STS分子標(biāo)記S26M47對(duì)124份小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)(圖1、表3)發(fā)現(xiàn)，32份小麥種質(zhì)可擴(kuò)增出目的條帶,說(shuō)明這些材料含有Yr10基因；其他92份材料均沒(méi)有擴(kuò)增出目的條帶，說(shuō)明這些材料不含Yr10基因，檢出率為 25.81%。

1—34為小麥種質(zhì)，名稱見(jiàn)表1。M為DNA Marker，從上到下分別為1 000、750、500、250、100 bp。下同

種質(zhì)名稱GermplasmnameYr10Yr15Yr24病級(jí)Diseasegrade種質(zhì)名稱GermplasmnameYr10Yr15Yr24病級(jí)Diseasegrade濟(jì)麥22Jimai22-?+0;川農(nóng)19Chuannong19-?+1～2濟(jì)南17Ji’nan17-?+4川育40109Chuanyu40109---4鄭麥366Zhengmai366-++4內(nèi)麥9號(hào)NeimaiNo.9-++3～4周麥16Zhoumai16-??4綿陽(yáng)33Mianyang33+?+4周麥18Zhoumai18--?2～3安麥6號(hào)AnmaiNo.6-?+1～2周麥22Zhoumai22---1～2資麥1號(hào)ZimaiNo.1+?+1～2溫麥6號(hào)WenmaiNo.6-?+4豐優(yōu)7號(hào)FengyouNo.7+??4矮早781Aizao781-??4寧春38Ningchun38-?+3～4偃師4110Yanzhan4110-??4寧冬11Ningdong11+?+4內(nèi)鄉(xiāng)188Neixiang188---4新春9號(hào)XinchunNo.9+??4新寶豐7228Xinbaofeng7228-??4山前麥2號(hào)ShanqianmaiNo.2---4百農(nóng)64Bainong64-?+0;張掖冬麥-1Zhangyedongmai-1-?+4百農(nóng)矮抗58Bainongaikang58---1～2揚(yáng)00-126Yang00-126-++4高優(yōu)503Gaoyou503-?+4揚(yáng)麥16Yangmai16-++4小偃22-10Xiaoyan22-10+?+4生選4號(hào)ShengxuanNo.4-++3～4山東055525Shandong055525+?+4南農(nóng)9918Nannong9918-++3～4中優(yōu)9507Zhongyou9507+++3～4南05Y628Nan05Y628-++4新麥26Xinmai26-++2～3南農(nóng)02Y393Nannong02Y393-+?4百泉3039Baiquan3039-++4鄂麥19號(hào)EmaiNo.19---1～2師欒02-1Shiluan02-1-?+4襄麥55Xiangmai55-?+4鄭育麥9987Zhengyumai9987+??2漢北麥Hanbeimai-?+4鄭麥004Zhengmai004---2～3武漢麥Wuhanmai-?+3洛麥23Luomai23-?+4攀道拉Pandaola+++2蘭考198Lankao198-??3～4智矮早Zhiaizao---4豫農(nóng)201Yunong201---4硬質(zhì)博萊特Yingzhibolaite-?+2～3浚麥99-7Xunmai99-7-++4CL0401-?+2～3新麥208Xinmai208---4CL0407(早)CL0407(Early)+?+1新麥18Xinmai18-++4OTTO(CL0419)+?+2～3荔高6號(hào)LigaoNo.6-++3～4CL0438+?+1～2西農(nóng)2208Xinong2208-?+3～4CL0442+?+3～4小偃81-54Xiaoyan81-54-++4HUAYUN--?0;鄭麥9023Zhengmai9023-++4PANDORA++?3濟(jì)麥20號(hào)JimaiNo.20+?+4TAMOI-++1～2濟(jì)麥21號(hào)JimaiNo.21+?+4CIKO+?+2～3邯6172Han6172---3～409智引1號(hào)09ZhiyinNo.1+?+0;邯4589Han4589---409智引2號(hào)09ZhiyinNo.2+?+1～2科農(nóng)199Kenong199---409智引3號(hào)09ZhiyinNo.3-?+1～2魯麥14Lumai14-??4CARMEN+?+0

續(xù)表3 小麥種質(zhì)抗條銹病基因分布及抗病性鑒定

注：+.存在；-.不存在；?.不確定，只檢測(cè)到1個(gè)標(biāo)記。發(fā)病病級(jí)為4個(gè)年份綜合結(jié)果。

Note:+. Present;-. Absent;?. Unknown，only one marker is detected.The disease grade in Tab.3 is a comprehensive result of four years.

2.2 小麥種質(zhì)中抗條銹病基因Yr15的檢測(cè)分析

利用與Yr15基因兩翼緊密連鎖的STS標(biāo)記Xbarc8和SSR標(biāo)記Xgwm413對(duì)124份小麥種質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果(圖2、表3)發(fā)現(xiàn)，Xbarc8標(biāo)記檢測(cè)出95份種質(zhì)可擴(kuò)增出260 bp的目的條帶，占76.61%；Xgwm413標(biāo)記檢出31份種質(zhì)可擴(kuò)增出115 bp的目的條帶,占25.00%。Xbarc8和Xgwm413標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)到目的條帶的種質(zhì)有28份，占22.58%，說(shuō)明這些種質(zhì)攜帶Yr15基因。

圖2 部分小麥種質(zhì)中Yr15基因分子標(biāo)記Xbarc8(A)和Xgwm413(B)的檢測(cè)

2.3 小麥種質(zhì)中抗條銹病基因Yr24的檢測(cè)分析

利用與Yr24連鎖的兩側(cè)SSR標(biāo)記Xbarc187和Xgwm498檢測(cè)124份小麥種質(zhì)。結(jié)果(圖3、表3)發(fā)現(xiàn)，Xbarc187標(biāo)記檢測(cè)出85份種質(zhì)可擴(kuò)增出目的條帶，占68.55%；Xgwm498標(biāo)記檢測(cè)出97份種質(zhì)可擴(kuò)增出目的條帶，占78.23%。Xbarc187和Xgwm498標(biāo)記同時(shí)檢測(cè)到目的條帶的種質(zhì)有80份,占64.52%，說(shuō)明這些種質(zhì)攜帶Yr24基因。

圖3 部分小麥種質(zhì)中Yr24基因分子標(biāo)記Xbarc187(A)和Xgwm498(B)的檢測(cè)

2.4 小麥種質(zhì)中抗條銹病基因的分布及其抗病性評(píng)價(jià)

由表3可知，124份小麥種質(zhì)中共有29份對(duì)CYR32和CYR33混合菌表現(xiàn)中抗及以上水平，其中，9份表現(xiàn)免疫或近免疫，2份表現(xiàn)高抗，16份表現(xiàn)中抗到高抗，2份表現(xiàn)中抗；83份種質(zhì)表現(xiàn)感病，占總鑒定材料的66.94%，其中，4份表現(xiàn)中感，17份表現(xiàn)中感到高感，62份表現(xiàn)高感；12份種質(zhì)表現(xiàn)中感到中抗，占總鑒定材料的9.68%。本研究中鑒定的抗性新種質(zhì)尤其是外引種質(zhì)將為我國(guó)抗條銹品種改良提供重要的種質(zhì)資源。

經(jīng)分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，攜帶Yr10、Yr15、Yr24基因的小麥種質(zhì)分別有32、28、80份，分別占供試材料的25.81%、22.58%、64.52%。其中，29份表現(xiàn)中抗及以上水平的種質(zhì)中，12份含有Yr10基因，包括鄭育麥9987、農(nóng)大189、資麥1號(hào)、攀道拉、CL0407(早)、CL0438、09智引1號(hào)、09智引2號(hào)、CARMEN、墨S139、莫斯科39和澳阿優(yōu)1號(hào)；3份含有Yr15基因，包括TAMOI、攀道拉和澳阿優(yōu)1號(hào)；22份含有Yr24基因，其中，濟(jì)麥22、百農(nóng)64、農(nóng)大189、內(nèi)麥836、云麥57、09智引1號(hào)、CARMEN和法國(guó)財(cái)富麥等8份達(dá)到免疫或近免疫水平；同時(shí)含有Yr10、Yr15、Yr24基因且表現(xiàn)抗病的資源有攀道拉和澳阿優(yōu)1號(hào)。周麥22、百農(nóng)矮抗58、新麥19、鄂麥19號(hào)、HUAYUN和MRYC等6份材料未檢測(cè)到上述基因(分子標(biāo)記)的存在，其抗性可能受其他基因控制。

3 結(jié)論與討論

利用現(xiàn)有與Yr基因共分離或緊密連鎖的SCAR、STS和SSR等分子標(biāo)記快速、準(zhǔn)確鑒定生產(chǎn)品種對(duì)條銹病的抗性水平及其攜帶Yr基因種類，對(duì)于小麥安全生產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)抗源合理布局及品種抗性改良具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)，92份國(guó)內(nèi)小麥種質(zhì)中有13份、32份國(guó)外小麥種質(zhì)中有16份種質(zhì)對(duì)條銹菌混合小種(CYR32、CYR33)表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定抗性，共占供試材料的23.39%；攜帶Yr10、Yr15、Yr24基因的小麥種質(zhì)分別有32、28、80份，分別占供試材料的25.81%、22.58%、64.52%。李峰奇等[13]對(duì)126份中國(guó)黃淮麥區(qū)重要的小麥品種(系)進(jìn)行抗條銹病基因分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn) ，攜帶Yr9基因的小麥材料所占比例最高(占41.6%)，Yr5、Yr10、Yr15和Yr26基因的分布頻率較低，而Yr9基因已喪失對(duì)生理小種CYR32和CYR33的抗性。韓德俊等[19]以Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26等已知抗條銹病基因的分子標(biāo)記對(duì)1 980份小麥地方品種和國(guó)外種質(zhì)進(jìn)行分子檢測(cè)及抗條銹病性鑒定，發(fā)現(xiàn)50份抗病材料中僅有2份材料可能攜帶Yr10基因，未發(fā)現(xiàn)攜帶Yr5、Yr15和Yr26的材料。說(shuō)明我國(guó)主產(chǎn)區(qū)小麥品種及地方品種抗條銹病優(yōu)勢(shì)生理小種CYR32和CYR33的水平依然較低，今后需要加大力度篩選、利用國(guó)外優(yōu)異抗源改良現(xiàn)有品種抗性。

抗病育種策略是使生產(chǎn)品種具有盡可能廣泛而穩(wěn)定的抗病遺傳基礎(chǔ)，抗病基因的有效組合，將會(huì)提高品種抗病性水平，使抗病性表現(xiàn)更加持久[12]。本研究檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，含有2個(gè)或3個(gè)抗性基因(Yr10、Yr15、Yr24)的種質(zhì)，如農(nóng)大189、資麥1號(hào)、攀道拉和澳阿優(yōu)1號(hào)等，可用于條銹病抗性改良，這對(duì)提高黃海麥區(qū)抗病品種抗性的持久性將具有較好的借鑒作用。另外，含Yr26基因的種質(zhì)在育種中被廣泛而單一地利用及CRY34新小種的出現(xiàn)，導(dǎo)致Yr24/Yr26抗性逐漸喪失，而Yr10和Yr15對(duì)新生理小種CRY34具有較好的免疫效果，具有較大的應(yīng)用潛力[20]。建議利用Yr10、Yr15和Yr24/Yr26及其他新的有效的全生育期抗病基因開(kāi)展多基因聚合育種，以提高當(dāng)?shù)匦←溒贩N的抗條銹病性。近期研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)攜帶Yr15和Yr64基因的重組自交系有更好的抗性效果[21]。因此，下一步開(kāi)發(fā)1BS上的Yr64分子標(biāo)記,并結(jié)合Yr15、Yr10、Yr24/Yr26等基因的分子標(biāo)記，對(duì)于輔助篩選新的種質(zhì)資源和新生理小種抗性分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。

利用田間表現(xiàn)穩(wěn)定抗病性的材料鑒定新的抗病基因及分子標(biāo)記對(duì)持續(xù)穩(wěn)定分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。周麥22、百農(nóng)矮抗58、新麥19、鄂麥19號(hào)、MRYC和HUAYUN等種質(zhì)不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但田間表現(xiàn)較好的抗病性，它們可能存在其他抗條銹病基因。周麥22和矮抗58的抗病性可能來(lái)自染色體7BL上的YrZH84基因[14]；鄂麥19號(hào)采用多親本近緣種復(fù)合雜交育種，其抗性可能來(lái)自近緣種；新麥19的檢測(cè)結(jié)果與前人[14]一致，不含Yr10、Yr15、Yr24基因，但在成株期對(duì)生理小種CRY32和CRY33表現(xiàn)較高抗性[14]，可能存在其他抗條銹基因。