陳千權(quán)，王野影

(貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴安 550025)

高種群密度環(huán)境易導(dǎo)致寄生和疾病發(fā)生，因此，隨著種群密度增加，個體感染疾病的概率也相應(yīng)增加。在長期進(jìn)化和自然選擇過程中，個體發(fā)展出能感知種群密度并能根據(jù)種群密度調(diào)整免疫反應(yīng)的能力[1]。與病原體感染相似，高種群密度可提升昆蟲的預(yù)防性免疫能力。昆蟲免疫系統(tǒng)包括體液免疫和細(xì)胞免疫，前者主要包括抗菌肽和酶聯(lián)反應(yīng)，后者主要包括血細(xì)胞防御反應(yīng)，如吞噬作用和封閉作用[2-3]。由于缺乏后天免疫系統(tǒng)，昆蟲能識別非自身抗原并能迅速放大感染信號。感染信號主要通過Toll和IMD(Immune deficiency)通路進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活脂肪體中表達(dá)抗菌肽并釋放到血淋巴中。先天免疫系統(tǒng)是昆蟲對抗細(xì)菌、真菌和病毒等病原體入侵的重要防線。革蘭氏陽性菌和真菌可激活Toll信號通路而激活抗菌肽表達(dá)，而革蘭氏陰性菌主要通過激活I(lǐng)MD信號通路而激活抗菌肽表達(dá)[4]。果蠅中Toll-1和Toll-9過表達(dá)可誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)[5]，Toll-5和Toll-9能激活抗真菌肽(Drosomycin)的表達(dá)[6]。病毒可通過Toll-7而激活抗病毒自噬反應(yīng)[6]，通過自噬抑制病毒復(fù)制[7],而Toll-8負(fù)調(diào)控呼吸道上皮抗微生物反應(yīng)[8]。Toll信號通路除參與免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)外也調(diào)控發(fā)育過程。Toll-2參與卵泡細(xì)胞及唾液腺發(fā)育[9]，Toll-7和Toll-10調(diào)控胚胎發(fā)育過程中前后軸延伸[10]，Toll-8參與胚胎時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腿發(fā)育[9]。與此相似，家蠶Toll-1和Toll-2在卵巢中高表達(dá)，二者可能在胚胎發(fā)育中具有重要作用[11]。Toll信號通路相關(guān)基因?qū)ハx生存至關(guān)重要，因此，其相關(guān)基因可作為有害昆蟲管理的靶基因[12]。

四紋豆象是全球分布的重要倉儲害蟲，依賴種群密度展現(xiàn)明顯的表型可塑性，即在高種群密度條件下，個體行為更活躍、個體發(fā)育更快速、性成熟更早、產(chǎn)卵更早、產(chǎn)卵數(shù)量更少[13]。四紋豆象免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因尚未鑒定，相關(guān)基因的表達(dá)量與種群密度的關(guān)系仍不清楚。鑒于此，本研究嘗試從四紋豆象轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗菌肽相關(guān)基因，并闡明這些基因表達(dá)量與種群密度的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 昆蟲飼養(yǎng)

野生四紋豆象經(jīng)形態(tài)和細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ測序鑒定后，于2016年7月將其引入并飼養(yǎng)。組織培養(yǎng)瓶(0.2 L)蓋上開5 cm × 5 cm孔，用紗布封住，既保證透氣又防止四紋豆象逃逸。在盛有100粒黑綠豆的瓶中置入2對豆象，以建立低密度試驗種群。在盛有相同數(shù)量黑綠豆的瓶中置入15對豆象，以建立高密度試驗種群。飼養(yǎng)5代后開始試驗，每個密度設(shè)立3個生物重復(fù)。飼養(yǎng)條件：溫度為(30±2)℃，光周期L∶D為16∶8，相對濕度為50%～70%。

1.2 Toll、IMD與抗菌肽基因的鑒定

從FlyBase中下載黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)Toll與IMD相關(guān)蛋白質(zhì)序列：Toll-1(CG5490)、Toll-2(CG8896)、Toll-3(CG1149)、Toll-4(CG18241)、Toll-5(CG7121)、Toll-6(CG7250)、Toll-7(CG8595)、Toll-8(CG6890)、Toll-9(CG5528)、IMD(CG5576)、肽聚糖識別蛋白LC[PGRP-LC(CG4432)]。從NCBI中下載赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)Toll、IMD相關(guān)蛋白質(zhì)序列：Toll-1(Tc000176，NCBI：LOC655507)、Toll-2(Tc004452，NCBI：LOC662755)、Toll-3(Tc004438，NCBI：LOC656158)、Toll-4(Tc004439，NCBI：LOC656071)、Toll-6(Tc004895，NCBI：LOC660697)、Toll-7(Tc004474，NCBI：LOC661135)、Toll-8(Tc004898，NCBI：LOC660808)、Toll-9(Tc033974，NCBI：LOC662131)、Toll-10(Tc004901，NCBI：LOC661030)、IMD(XP_008199405.1)、PGRP-LC(XP_008192547.1)。

從FlyBase中下載黑腹果蠅抗菌肽蛋白序列：Drosomycin(CG10810)、Defensin(CG1385)、Cecropin A1(CG1365)、Cecropin A2(CG1367)、Drosocin(CG10816)、Metchnikowin(CG8175)。從NCBI中下載鞘翅目昆蟲抗菌肽蛋白序列：黃粉蟲(Tenebriomolitor)Tenecin-1(BAA04552.1)，東北大黑鰓金龜(Holotrichiadiomphalia)Holotricin-1(2107186A)，三開蜣螂(Copristripartitus)Coprisin(ABP97087.1)，ZophobatratusDefensin B(AAB20745.1)、Defensin C(AAB20746.1)，古銅異麗金龜(Anomalacuprea)Defensin A(BAD77966.1)、Defensin B(BAD77967.1)，犀角金龜(Oryctesrhinoceros)Defensin(BAA36401.1)，獨角仙(Allomyrinadichotoma)Defensin(AAB36306.1)，AcaloleptaluxuriosaDefensin 1(AAK35160.1),Cecropin(BAD66670.1)。鑒于缺乏鞘翅目昆蟲富含脯氨酸抗菌肽信息，而鞘翅目與膜翅目親緣關(guān)系相對較近，下載相關(guān)膜翅目抗菌肽蛋白序列：意大利蜜蜂(Apismellifera)Apidaecin-1(P35581.1)、Apidaecin-2(Q06601.1)、Abaecin(NP_001011617.1)，紅牛頭犬蟻(Myrmeciagulosa)Formaecin(P81437.1)，BombuspascuorumApidaecin(P81464.1)、Abaecin(P81463.1)，PteromaluspuparumAbaecin-like(ABS44869.1)。

從NCBI下載四紋豆象腹部轉(zhuǎn)錄組序列[14]。在Bioedit中通過本地tBLASTn比對鑒定相關(guān)基因，將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)后，在Molecular Evolutionary Genetic Analysis software version 6(MEGA 6)中經(jīng)多重比對(ClustalW)后構(gòu)建最大似然(Maximum likelihood)進(jìn)化樹，重復(fù)次數(shù)為1 000次。蛋白質(zhì)序列之間的一致性(Identities)、相似性(Positives)和間隙(Gaps)通過Bioedit軟件計算。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域采用SMART程序(https://smart.embl.de/)預(yù)測。

1.3 表達(dá)量分析

四紋豆象腹部組織經(jīng)液氮速凍并轉(zhuǎn)移至-80 ℃保存，部分組織樣品送北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行高通量測序，以特定基因片段數(shù)量除以其長度后對上述所有序列數(shù)量的比值(Fragments per kilobase of exon per million reads mapped，F(xiàn)PKM)衡量基因表達(dá)量。以t檢驗判定相應(yīng)基因在高密度群體和低密度群體中的表達(dá)水平是否存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 四紋豆象Toll與IMD相關(guān)基因的鑒定

面對革蘭氏陽性菌和真菌時，昆蟲通過Toll信號通路提升預(yù)防性免疫，而面對革蘭氏陰性菌時，昆蟲通過IMD信號通路提升預(yù)防性免疫。與病原體感染相似，高種群密度可提升昆蟲的預(yù)防性免疫。為揭示種群密度調(diào)控四紋豆象免疫反應(yīng)的信號通路，從四紋豆象腹部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到Toll信號通路的關(guān)鍵受體基因Toll-1、Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10；IMD信號通路的胞內(nèi)關(guān)鍵信號分子基因IMD和受體基因PGRP-LC(肽聚糖識別蛋白LC基因)(表1)。

表1 四紋豆象Toll與IMD基因序列號Tab.1 Sequence numbers of Toll and IMD genes in Callosobruchus maculatus

通過轉(zhuǎn)錄組所得Toll相關(guān)基因的部分序列，Toll-1、Toll-8、Toll-10序列較短而Toll-3、Toll-6、Toll-7序列較長(圖1A)。將四紋豆象Toll基因序列翻譯為蛋白質(zhì)序列后進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測，發(fā)現(xiàn)Toll-1有3個富含亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeats，LRR)、3個典型富含亮氨酸重復(fù)(Leucine-rich repeats typical，LRR_TYP)。Toll-3有9個富含亮氨酸重復(fù)、3個典型富含亮氨酸重復(fù)、1個富含亮氨酸重復(fù)的N端結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat N-terminal domain，LRR-NT)、1個跨膜區(qū)(Transmembrane region，TR)、1個Toll-白細(xì)胞介素1抗性結(jié)構(gòu)域(Toll-interleukin 1-resistance，TIR)。Toll-6有17個富含亮氨酸重復(fù)、4個典型富含亮氨酸重復(fù)、1個富含亮氨酸重復(fù)的C端結(jié)構(gòu)域(Leucine-rich repeat C-terminal domain，LRR-CT)、1個富含亮氨酸重復(fù)的N端結(jié)構(gòu)域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細(xì)胞介素1抗性結(jié)構(gòu)域。Toll-7有15個富含亮氨酸重復(fù)、6個典型富含亮氨酸重復(fù)、2個富含亮氨酸重復(fù)的C端結(jié)構(gòu)域、1個富含亮氨酸重復(fù)的N端結(jié)構(gòu)域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細(xì)胞介素1抗性結(jié)構(gòu)域。Toll-8具有3個富含亮氨酸重復(fù)、1個典型富含亮氨酸重復(fù)、1個富含亮氨酸重復(fù)的N端結(jié)構(gòu)域、1個跨膜區(qū)、1個Toll-白細(xì)胞介素1抗性結(jié)構(gòu)域。Toll-10具有12個富含亮氨酸重復(fù)、5個典型富含亮氨酸重復(fù)。TIR結(jié)構(gòu)域長度為140個氨基酸左右，是信號傳導(dǎo)所必需的，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)，35個位點氨基酸高度保守(圖1B)。

A：Toll蛋白結(jié)構(gòu)域；B：Toll-白細(xì)胞介素1抗性結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)序列比對。為高度保守位點，下同

在Toll-1氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、50%、10%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、47%、8%。在Toll-3氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為39%、58%、2%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為22%、42%、16%。在Toll-6氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性高達(dá)85%，相似性高達(dá)93%，間隙為0；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性為58%，相似性為75%，間隙為2%。在Toll-7氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為81%、89%、2%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為56%、69%、10%。在Toll-8氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為83%、93%、0；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為51%、66%、10%。果蠅缺乏Toll-10，而四紋豆象和赤擬谷盜中都鑒定到Toll-10，二者Toll-10氨基酸一致性、相似性、間隙分別為77%、88%、0。由此可見，Toll-1、Toll-3、Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6進(jìn)化速率依次降低(圖2A)。

在IMD氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為42%、58%、4%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為31%、50%、14%。在PGRP-LC氨基酸序列相似性方面，四紋豆象與赤擬谷盜氨基酸一致性、相似性、間隙分別為42%、59%、9%；四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為29%、46%、14%。由此可見，IMD和PGRP-LC的進(jìn)化速率與Toll-3相似(圖2B)。

A：Toll進(jìn)化樹；B：IMD與PGRP-LC進(jìn)化樹

2.2 四紋豆象Toll、IMD相關(guān)基因表達(dá)量與種群密度的關(guān)系

在四紋豆象腹部組織中，Toll-1基因表達(dá)水平最低，其FPKM值為0.32。除Toll-1的表達(dá)量不受種群密度影響外(t=0.05，P=0.960)，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10的表達(dá)量在高密度群體中顯著或極顯著上調(diào)(圖3)。其中，Toll-10上調(diào)1.1倍(t=4.3，P=0.010)，Toll-8上調(diào)1.2倍(t=6.21，P=0.003)，Toll-6上調(diào)1.0倍(t=6.65，P=0.003)，Toll-3上調(diào)0.6倍(t=10.72，P=0.002)。Toll-7表達(dá)水平最高，其在高密度群體和低密度群體中的FPKM值分別為127.25、57.92，在高密度群體中上調(diào)1.2倍(t=5.67，P=0.005)。IMD和PGRP-LC的表達(dá)量未出現(xiàn)明顯上調(diào)。

H：高密度；L：低密度。*、**分別表示高密度和低密度群體中基因表達(dá)量差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同

2.3 四紋豆象抗菌肽基因的鑒定與表達(dá)量分析

革蘭氏陽性菌和真菌可激活昆蟲的Toll信號通路進(jìn)而激活抗菌肽表達(dá)，而革蘭氏陰性菌通過激活I(lǐng)MD信號通路進(jìn)而激活抗菌肽表達(dá)?？咕氖抢ハx抵御病原體入侵的重要防線。由表2可知，從轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到7個抗菌肽基因：1個Defensin(防御素基因)、1個Cecropin(天蠶素基因)、2個Apidaecin(蜜蜂抗菌肽基因)、3個Drosomycin(抗真菌肽基因)。

表2 四紋豆象抗菌肽基因序列號Tab.2 Sequence numbers of antimicrobial peptide genes in callosobruchus maculatus

在Cecropin序列相似性方面，四紋豆象與近緣物種A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、間隙分別為46%、67%、0，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為32%、46%、4%(圖4A)。在Defensin序列相似性方面，四紋豆象與近緣物種A.luxuriosa氨基酸一致性、相似性、間隙分別為46%、73%、1%,四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為32%、48%、19%。在Apidaecin-1序列相似性方面，四紋豆象與蜜蜂氨基酸一致性、相似性、間隙分別為33%、42%、13%。在Apidaecin-2序列相似性方面，四紋豆象與蜜蜂氨基酸一致性、相似性、間隙分別為28%、35%、13%。四紋豆象的Apidaecin-1與Apidaecin-2氨基酸一致性、相似性、間隙分別為30%、38%、15%。在Drosomycin-1序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為82%、89%、4%。在Drosomycin-2序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為69%、81%、3%。在Drosomycin-3序列相似性方面，四紋豆象與果蠅氨基酸一致性、相似性、間隙分別為86%、88%、4%。在四紋豆象的Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3蛋白序列相似性方面，任意二者的一致性均為95%、相似性均為100%。在核苷酸水平上，Drosomycin-1與Drosomycin-2的一致性為93%；Drosomycin-1與Drosomycin-3的一致性為81%；Drosomycin-2與Drosomycin-3的一致性為83%(圖4B)。由此可見，Drosomycin-3在進(jìn)化中最保守。

在表達(dá)量方面，Apidaecin-1表達(dá)量最低，其FPKM值為6.58(圖4C)。種群密度對Apidaecin-1、Cecropin和Apidaecin-2的表達(dá)量無顯著影響。Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3分別在高密度群體中上調(diào)6.6倍(t=7.07，P=0.002)、2.5倍(t=5.58，P=0.005)、1.8倍(t=11.70，P=0.000 3)。Defensin表達(dá)量最高，高密度群體和低密度群體的FPKM值分別為1 277.23和683.87，其在高密度群體中上調(diào)0.9倍(t=4.18，P=0.025)。

Acu：古銅異麗金龜;Adi：獨角仙;Alu：Acalolepta luxuriosa;Ame：意大利蜜蜂;Bpa：Bombus pascuorum;Ctr：三開蜣螂;Hdi：東北大黑鰓金龜;Mgu：紅牛頭犬蟻;Orh：犀角金龜;Ppu：Pteromalus puparum;Tmo：黃粉蟲;Zat：Zophob atratus

3 結(jié)論與討論

Toll信號通路負(fù)責(zé)革蘭氏陽性菌和真菌信號傳導(dǎo),本研究共從四紋豆象腹部轉(zhuǎn)錄組中鑒定到6個Toll信號通路受體基因，其蛋白質(zhì)都有富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域。其中，Toll-1進(jìn)化速率較快，Toll-3進(jìn)化速率略慢于Toll-1，而Toll-10、Toll-7、Toll-8、Toll-6緊隨其后，進(jìn)化速率依次降低。革蘭氏陰性菌主要通過IMD信號通路傳導(dǎo)。本研究從腹部轉(zhuǎn)錄組中鑒定到IMD信號通路的胞內(nèi)關(guān)鍵信號分子基因IMD和受體基因PGRP-LC。IMD和PGRP-LC的進(jìn)化速率與Toll-3相似。

表達(dá)量方面，除Toll-1外，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10在高密度群體中上調(diào)。其中，Toll-7表達(dá)量最高。果蠅中Toll-7和Toll-10參與胚胎時期前后軸延伸[10]，Toll-8參與胚胎時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腿發(fā)育[9]。四紋豆象在高密度條件下個體發(fā)育更迅速、性成熟更早、后代胚胎發(fā)育更快速和整齊。四紋豆象腹部主要包括脂肪體和卵巢，其均參與繁殖過程。上調(diào)的Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能參與雌性個體發(fā)育、性成熟及后代的胚胎發(fā)育。與此相似，家蠶Toll基因在卵巢中高表達(dá)，其可能參與胚胎發(fā)育[11]。除調(diào)控發(fā)育功能外，Toll的重要作用是參與免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，革蘭氏陽性菌、真菌和病毒可激活Toll信號通路，從而激活抗菌肽表達(dá)。如Toll-7可激活抗病毒自噬反應(yīng)[6]，通過自噬抑制病毒復(fù)制[7]。Toll-8可負(fù)調(diào)控呼吸道上皮抗微生物反應(yīng)[8]。果蠅中Toll-1可明顯調(diào)控免疫反應(yīng)，其過表達(dá)可誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)[5]。在四紋豆象中，Toll-1表達(dá)量最低且種群密度對其表達(dá)量無顯著影響，因此，Toll-1在四紋豆象種群密度引起的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中不起關(guān)鍵作用。種群密度對IMD和PGRP-LC表達(dá)量無明顯調(diào)控作用，因此，IMD信號通路在種群密度引起的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中不起關(guān)鍵作用。由此可見，Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10可能在種群密度引起的免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。

革蘭氏陽性菌和真菌可激活昆蟲的Toll信號通路而激活抗菌肽表達(dá)，而革蘭氏陰性菌通過激活I(lǐng)MD信號通路而激活抗菌肽表達(dá)[4]。抗菌肽是昆蟲抵御病原體入侵的重要防線。本研究從轉(zhuǎn)錄組中共鑒定到7個抗菌肽基因： 1個Cecropin、1個Defensin、2個Apidaecin、3個Drosomycin。其中，Cecropin、Apidaecin-1和Apidaecin-2的表達(dá)量在高密度群體中無顯著上調(diào)或下調(diào)，而Defensin和3個Drosomycin在高密度群體中顯著上調(diào)。高種群密度通過上調(diào)Defensin和3個Drosomycin的表達(dá)量提升昆蟲的預(yù)防性免疫能力，降低個體被感染的概率。Toll-3、Toll-6、Toll-7、Toll-8、Toll-10與Defensin、Drosomycin-1、Drosomycin-2、Drosomycin-3的調(diào)控關(guān)系仍不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

四紋豆象免疫信號與抗菌肽相關(guān)基因的鑒定及表達(dá)量分析有利于進(jìn)一步揭示相關(guān)基因在免疫應(yīng)答和個體發(fā)育中的作用，闡明種群密度介導(dǎo)的預(yù)防性免疫的具體分子途徑。